Anvendelse fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) til at undersøge Effector translokationseffektivitet af<em> Coxiella burnetii</em> Under siRNA Silencing
Summary
Undersøge samspillet mellem bakterielle patogener og deres værter er et vigtigt område for biologisk forskning. Her beskriver vi de nødvendige teknikker til at måle effektor translokation af Coxiella burnetii under siRNA gendæmpning hjælp BlaM substrat.
Abstract
Coxiella burnetii, det agens af Q-feber, er et intracellulært patogen, der bygger på en type IV Dot / Icm Sekretion System at etablere et replikativt niche. En kohorte af effektorer translokeres via dette system i værtscellen til at manipulere vært processer og tillade etableringen af et unikt lysosom-afledt vacuole for replikation. Fremgangsmåden præsenteres her involverer kombinationen af to veletablerede teknikker: specifik gendæmpning hjælp siRNA og måling af effektor translokation anvendelse af en FRET-baseret substrat, der er afhængig af β-lactamase-aktivitet. Anvendelsen af disse to tilgange, kan vi begynde at forstå betydningen af værten faktorer i bakteriel sekretion-system funktion og effektor translokation. I dette studie undersøgte vi rollen som Rab5A og Rab7A, som begge er vigtige regulatorer af endocytiske trafficking pathway. Vi viser, at silencing ekspressionen af enten protein resulterer i en formindskelse af effektor translocation effektivitet. Disse fremgangsmåder kan let modificeres til at undersøge andre intracellulære og ekstracellulære patogener, der også udnytter sekretionssystemer. På denne måde kan et samlet billede af værten faktorer involveret i bakteriel effektor translokation blive afsløret.
Introduction
Coxiella burnetii er en unik intracellulært patogen, som forårsager den zoonotiske infektioner hos mennesker Q-feber. Denne sygdom er forbundet med et bredt spektrum af kliniske præsentationer strækker sig fra asymptomatisk serokonversion til livstruende kronisk infektion, som ofte manifesterer sig som endocarditis år efter eksponering 1. Menneskelig infektion forekommer primært gennem indånding af forurenede aerosoler med drøvtyggere den største reservoir for infektion, især malkekøer, får og geder. Selv Coxiella infektion i disse dyr er typisk subklinisk, kan infektionen udløse abort og den betydelige bakterielle belastning i fødende væske og placenta kan forurene det lokale miljø en. Et eksempel på den enorme byrde sådan kontaminering kan have på både folkesundheden og landbrugsindustrien blev for nylig observeret i Q-feber udbrud, der fandt sted i Holland 2. Mellem 2007 og2010 blev over 4.000 humane tilfælde af Q-feber diagnosticeret og dette udbrud var forbundet med betydelig forurening af ged gårde 3. Derudover Coxiella er en potentiel biologisk våben, som klassificeret af det amerikanske Centers for Disease Control og Forebyggelse, på grund af den miljømæssige stabilitet bakterier og lav infektiøs dosis nødvendig for at forårsage alvorlig sygelighed og dødelighed 4.
Coxiella eksisterer i to faser: Fase I organismer, isoleret fra naturlige kilder, er yderst virulent og fase II organismer er stærkt svækket in vivo. For eksempel, efter flere in vitro passager af Coxiella burnetii Nine Mile Fase I organismer, blev fase II bakterier produceres der indeholder en irreversibel kromosomal deletion resulterer i afkortede lipopolysaccharid (LPS) 5. Denne stamme, C. burnetii NMII, er fænotypisk svarer til fase I i vævskultur modeller og giver en mere sikker tilstandl for forskerne at studere Coxiella patogenese i laboratorier 5. I de senere år har flere gennembrud hurtigt avancerede inden for Coxiella genetik. Mest bemærkelsesværdigt, udvikling af axenisk medier (syrnet citrat cystein medium – ACCM-2) har tilladt celle-fri vækst i Coxiella i både flydende og faste medier 6,7. Dette resulterede i direkte forbedringer af genetiske værktøjer til rådighed for Coxiella herunder et inducerbart genekspression systemet, shuttle vektorer og tilfældige transposon systemer 8-11. Senest har to metoder til målrettet gen inaktivering også blevet udviklet, hvilket banede vejen for behandlingen specifikke virulens gen kandidater 12.
Efter internalisering af alveolære makrofager, Coxiella replikerer til høje numre i en membranbundet rum betegnet Coxiella- indeholdende vacuolen (CCV). Den CCV kræver vært endocytiske handel thru tidlige og sene endosomer indtil det modnes til en lysosomer-afledt organel 13. I hele denne proces, CCV erhverver værten faktorer, enten vises forbigående eller forblive forbundet med vakuolet, herunder, men ikke begrænset til, Rab5, Rab7, CD63 og LAMP-1 13-15. Replikation af Coxiella inden værtsceller er helt afhængig af en fuldt funktionel Dot / Icm Type IVB Sekretion System (T4SS) 8,16,17. Denne sekretion system er en multi-proteinstruktur ancestrally relateret konjugering systemer og strækker sig over begge bakterielle og vakuolære membraner til at levere bakterielle proteiner, betegnet effektorer, i værtens cytoplasma 18. Coxiella T4SS er funktionelt meget lig den velkarakteriserede Type IVB Dot / Icm Sekretion System af Legionella pneumophila 19,20. Interessant nok aktivering af T4SS og efterfølgende effektor translokation ikke før Coxiella når den sure lysosomet-afledteorganel, ca. 8 timer efter infektion 17,21. Til dato har over 130 Dot / .icm effektorer blevet identificeret 9,17,22-24. Mange af disse effektorer sandsynligvis spiller en vigtig rolle under replikation af Coxiella inden værtsceller; har dog kun få effektorer blevet funktionelt karakteriseret 25-29.
I denne undersøgelse anvender vi en fluorescens baseret translokation assay, der bygger på spaltning af CCF2-AM FRET substrat (i det følgende benævnt BlaM substrat) via β-lactamase-aktivitet i værtscellen cytoplasma (figur 1). Genet af interesse er fusioneret til TEM-1 β-lactamase (BlaM) på et reporterplasmid, der tilvejebringer konstitutiv ekspression. Den BlaM Bundlaget består af to fluorophorer (coumarin og fluorescein), som danner et FRET-par. Excitation af coumarin resultater i FRET af fluorescein og grøn fluorescensemission i fraværet af effektor translokation; Men hvis BlaM-effektor-fusionsproteinet translokeres i værtens cytoplasma, den resulterende β-lactamase-aktivitet spalter β-lactamringen af BlaM substratet, adskillelse af FRET-par producerer blå fluorescensemission efter excitation. Denne translokation assay er blevet godt bevist som en tilgang til at identificere effektor proteiner fra en række forskellige intracellulære og ekstracellulære bakterier, herunder C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogene E. coli, salmonella og Brucella 17,30-35.
For at fastlægge den rolle, specifikke vært faktorer på Coxiella effektor translokation vi udnytte en veletableret metode til gendæmpning kaldet RNA-interferens, især små interfererende RNA (siRNA). Oprindeligt identificeret i Caenorhabditis elegans, RNA-interferens er et bevaret endogen cellulær proces, der anvendes til medfødte FORSVARSPOLITIKNSE mod virus samt genregulering 36,37. Efter binding af sekvens-specifikke siRNA, nedbrydning af mRNA forekommer gennem RISC (RNA-induceret silencing kompleks) resulterer i specifikt gen-nedregulering eller knockdown 38. I denne undersøgelse blev siRNA anvendes til at målrette to værtsproteiner, Rab5A og Rab7A, som er vigtige regulatorer af endocytiske proces. Virkningen af lyddæmpning Rab5A og Rab7A på effektor translokation blev konstateret ved hjælp af C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 blev valgt som det var tidligere vist at være omplantes af Dot / Icm sekretion system Coxiella 17.
Ved hjælp både siRNA gendæmpning og fluorescencebased translokation assay beskrives her, er vi begyndt at etablere en rolle for værten faktorer i translokationen af effektor proteiner ved Coxiella. Denne fremgangsmåde kan anvendes til en bred vifte af både intracellulære og ekstracellulære bakterier, der besidder lignende secretion-systemer, der er ansvarlige for translokation af effektor proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sekretionssystemer og de bakterielle effektor proteiner disse transportsystemer ind i cytoplasmaet af værtsceller, er en vigtig virulens komponent, mange patogene bakterier anvender til at etablere en infektion i unikke replikative nicher. Fokus for mange forskergrupper har været at undersøge samspillet mellem bakterielle effektorer og værtsproteiner og den indflydelse, disse effektorer har på værten cellulære veje. Meget begrænset forskning, om nogen, har undersøgt potentialet for værtsproteiner at være nød…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.
Materials
| Reagents | |||
| Citric acid | Sigma | C0759 | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218 | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Calbiochem | 442611 | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Fisher | S93248 | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852 | ACCM-2 medium component |
| Bacto-neopeptone | BD | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | Fisher | BP1424 | ACCM-2 medium component |
| Methyl beta cyclodextrin | Sigma | C4555 | ACCM-2 medium component |
| RPMI + Glutamax | ThermoFisher Scientific | 61870-036 | ACCM-2 medium component |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | For bacterial culture |
| ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) | Dharmacon | D-001810-10-05 | Non-targeting control |
| siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-003290-01-005 | Causes cell death; measure of transfection efficiency |
| siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-004009-00-0005 | |
| siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-010388-00-0005 | |
| 5X siRNA buffer | Dharmacon | B-002000-UB-100 | Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer |
| DharmaFECT-1 Transfection Reagent | Dharmacon | T-2001-01 | For transfection |
| Opti-MEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | Reduced-serum medium used for transfection |
| DMEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10567-014 | For cell culture and infection |
| Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Can use alternate equivalent product |
| DMSO | Sigma | D8418 | For storage of Coxiella strain |
| PBS | For cell culture | ||
| 0.05% Trypsin + EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | For cell culture |
| dH2O | For dilution of samples and standards for qPCR | ||
| Quick-gDNA Mini Prep | ZYMO Research | D3007 | Can use alternate equivalent product to extract gDNA |
| SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Bioline | BIO-98020 | Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM | Invitrogen | K1032 | For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO) |
| Sodium hydroxide | Merck | 106469 | Probenicid solution component |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | 71505 | Probenicid solution component |
| di-Sodium hydrogen orthophosphate | Merck | 106586 | Probenicid solution component |
| Probenicid | Sigma | P8761 | Probenicid solution component |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62251 | Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. |
| 4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS | Sigma | P6148 | Fixing solution for HeLa 229 cells |
| 25cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430639 | For growth of bacterial strain |
| 96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 3603 | |
| 75cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430641 | For growth of HeLa 229 cells |
| 175cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 431080 | For growth of HeLa 229 cells |
| Haemocytometer | For quantification of HeLa 229 cells | ||
| Tear-A-Way 96 Well PCR plates | 4titude | 4ti-0750/TA | For qPCR reaction |
| 8-Lid chain, flat | Sarstedt | 65.989.002 | For qPCR reaction |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bench top microfuge | |||
| Bench top vortex | |||
| Orbital mixer | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | For pelleting bacterial culture |
| Nanodrop | For gDNA quantification | ||
| Mx3005P QPCR machine | Aligent Technologies | 401456 | For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture |
| ClarioSTAR microplate reader | BMG LabTech | For measurement of fluorescence |
Riferimenti
- Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
- Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
- van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
- Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
- Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
- Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
- Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
- Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
- Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
- Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
- Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
- Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
- Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
- Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
- Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
- Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
- Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
- Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
- Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella’burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
- Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
- Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
- Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
- Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
- Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
- Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
- Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
- Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
- de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
- Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
- Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
- Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
- Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
- Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
- Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
- McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
- Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
- Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
- Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
- Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).
