Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em> Coxiella burnetii</em> Tijdens siRNA Silencing
Summary
Onderzoek naar de interactie tussen bacteriële pathogenen en hun gastheren is een belangrijk gebied van biologisch onderzoek. Hier beschrijven we de noodzakelijke technieken om effector translocatie door Coxiella burnetii tijdens siRNA gene silencing behulp blam substraat te meten.
Abstract
Coxiella burnetii, de verwekker van Q-koorts is een intracellulair pathogeen die is gebaseerd op een Type IV Dot / Icm secretiesysteem een replicatieve niche richten. Een cohort van effectoren van translocatie via dit systeem in de gastheercel gastheerprocessen manipuleren en kan de instelling van een uniek lysosoom afgeleide vacuole voor replicatie. De hier gepresenteerde methode omvat de combinatie van twee goed gevestigde technieken: specifiek gen silencing middels siRNA en meting van effector translocatie gebruik van een op FRET gebaseerde substraat dat is gebaseerd op β-lactamase-activiteit. De toepassing van deze twee benaderingen, kunnen we beginnen met de rol van gastheerfactoren in bacteriële secretie systeem functioneren en effector translocatie begrijpen. In deze studie onderzoeken we de rol van Rab5A en Rab7A, beide belangrijke regulatoren van de endocytische mensenhandel route. We tonen aan dat silencing de uitdrukking van eiwit resulteert in een afname van effector translocation efficiency. Deze werkwijzen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere intracellulaire en extracellulaire pathogenen die ook secretie systemen gebruiken onderzoeken. Op deze wijze kan een globaal beeld van gastheerfactoren betrokken in bacteriële translocatie effector geopenbaard.
Introduction
Coxiella burnetii is een unieke intracellulaire ziekteverwekker die de zoönotische menselijke besmetting Q-koorts veroorzaakt. Deze ziekte wordt geassocieerd met een breed spectrum van klinische presentaties uitstrekt van asymptomatische seroconversie tot levensbedreigende chronische infectie die vaak manifesteert als endocarditis jaar na blootstelling 1. Menselijke besmetting ontstaat voornamelijk door inhalatie van gecontamineerde aërosolen met herkauwers grote reservoir van infectie, in het bijzonder melkkoeien, schapen en geiten. Hoewel Coxiella-infectie bij deze dieren is meestal subklinische, kan de infectie leiden tot abortus en de aanzienlijke bacteriële belasting in het geboorteproces vloeistof en placenta kan de lokale omgeving 1 besmetten. Een voorbeeld van de enorme last dergelijke vervuiling kan hebben op zowel de volksgezondheid en de landbouwindustrie onlangs waargenomen in de Q-koorts die zich in Nederland 2. Tussen 2007 en2010, meer dan 4.000 menselijke gevallen van Q-koorts werden gediagnosticeerd en deze uitbraak was gekoppeld aan significante besmetting van geitenhouderijen 3. Bovendien, Coxiella een potentieel biologisch wapen, zoals geclassificeerd door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention, vanwege de milieustabiliteit van de bacteriën en lage infectieuze dosis nodig ernstige morbiditeit en mortaliteit 4 veroorzaken.
Coxiella bestaat in twee fasen: Fase I organismen, geïsoleerd uit natuurlijke bronnen, zijn zeer virulent en Fase II organismen sterk verzwakt in vivo. Bijvoorbeeld, na een aantal overzettingen in vitro van Coxiella burnetii Nine Mile organismen Fase I, Fase II bacteriën werden geleverd dat een onomkeerbare chromosomale deletie bevatten waardoor afgeknotte lipopolysaccharide (LPS) 5. Deze stam C. burnetii NMII, fenotypisch vergelijkbaar met Fase I in weefselkweek modellen en zorgt voor een veiligere modusl voor onderzoekers om Coxiella pathogenese in laboratoria 5 bestuderen. De laatste jaren hebben verscheidene doorbraken snel gevorderd het gebied van Coxiella genetica. Het meest opvallend is de ontwikkeling van axenische media (aangezuurd citraat cysteine midden – ACCM-2) heeft het celvrije groei van Coxiella toegestaan in zowel vloeibare en vaste media 6,7. Dit resulteerde in de directe verbetering van genetische hulpmiddelen beschikbaar voor Coxiella waaronder een induceerbare genexpressie systeem, shuttle vectoren en willekeurig transposon systemen 8-11. Meest recent, twee methoden voor doelgerichte geninactivatie zijn ook ontwikkeld, die de weg vrijmaakt voor de behandeling van specifieke virulentie-gen kandidaten 12.
Na internalisatie door alveolaire macrofagen, Coxiella gerepliceerd naar grote aantallen binnen een membraangebonden compartiment aangeduid als de Coxiella- met vacuole (CCV). Het CCV vereist gastheer endocytische mensenhandel thruwe vroege en late endosomen, totdat het rijpt in een lysosoom afgeleide organel 13. Gedurende dit proces, verkrijgt het CCV gastheer factoren die ofwel verschijnen tijdelijk of verbonden blijven met de vacuole, waaronder, maar niet beperkt tot, Rab5, Rab7, CD63 en LAMP-13-15 januari. Replicatie van Coxiella binnen gastheercellen is volledig afhankelijk van een volledig functionele Dot / Icm Type IVB Afscheiding System (T4SS) 8,16,17. Dit afscheidingssysteem is een multi-eiwitstructuur ancestrally betrekking conjugatie systemen en omvat zowel bacteriële als vacuolaire membranen bacteriële eiwitten leveren, genaamd effectoren, in de gastheercel cytoplasma 18. De Coxiella T4SS functioneel vergelijkbaar met de goed gekarakteriseerde Type IVB Dot / Icm afscheidingssysteem van Legionella pneumophila 19,20. Interessant is dat activering van de T4SS en daaropvolgende translocatie effector pas optreedt Coxiella de zure lysosoom afgeleide bereiktorganel, ongeveer 8 uur na infectie 17,21. Tot op heden hebben meer dan 130 Dot / Icm effectoren geïdentificeerd 9,17,22-24. Veel van deze effectoren waarschijnlijk een belangrijke rol spelen tijdens de replicatie van Coxiella binnen gastheercellen; Echter, slechts een paar effectoren zijn functioneel gekarakteriseerd 25-29.
In dit onderzoek gebruiken we een fluorescentie gebaseerde translocatie assay die is gebaseerd op splitsing van de CCF2-AM FRET substraat (hierna het BLAM substraat) via β-lactamase activiteit in de gastheercel cytoplasma (Figuur 1). Het gen van belang wordt gefuseerd aan TEM-1 β-lactamase (BLAM) op een reporterplasmide die constitutieve expressie verschaft. De BLAM substraat bestaat uit twee fluoroforen (coumarine en fluoresceïne), die een FRET-paar vormen. Excitatie van de cumarine in FRET resultaten van het fluoresceïne en groene fluorescentie-emissie in afwezigheid van effector translokatie; Indien de BlaM-effector-eiwit translocatie in de gastheer cytoplasma, de resulterende β-lactamase activiteit splitst de β-lactam ring van het BLAM substraat, het scheiden van het FRET paar producerende blauwe fluorescentie-emissie na excitatie. Deze translocatie assay is bewezen als een benadering van effector eiwitten te identificeren van een reeks verschillende intracellulaire en extracellulaire bacteriën, waaronder C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropathogene E. coli, Salmonella en Brucella 17,30-35.
Om de rol van specifieke host factoren op Coxiella effector translocatie bepalen we gebruik van een bekende methode voor het gene silencing bekend als RNA-interferentie, in het bijzonder kleine interfererende RNA (siRNA). Oorspronkelijk geïdentificeerd in Caenorhabditis elegans, RNA-interferentie is een geconserveerd endogeen cellulair proces dat wordt gebruikt voor het aangeboren defense tegen virussen en genregulatie 36,37. Na binding van sequentie-specifieke siRNA, afbraak van mRNA vindt plaats via RISC (RNA-geïnduceerd silencing complex) waardoor specifiek gen silencing of 38 knockdown. In deze studie werd gebruikt siRNA targeten twee gastheereiwitten, Rab5A en Rab7A, die belangrijke regulatoren van de endocytische route zijn. De impact van zwijgen Rab5A en Rab7A op effector translocatie werd vastgesteld met behulp van C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 werd geselecteerd als zij eerder werd aangetoond dat getransloceerd door de Dot / Icm secretie systeem van Coxiella 17.
Gebruik makend van beide siRNA gene silencing en de fluorescencebased translocatie test hier beschreven, beginnen we een rol voor host factoren te vestigen in de translocatie van effector eiwitten door Coxiella. Deze benadering kan worden toegepast op een breed scala aan zowel intracellulaire als extracellulaire bacteriën die vergelijkbaar secretio bezittenn systemen verantwoordelijk voor de translocatie van effector eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Secretiesystemen, en de bacteriële effector eiwitten deze transportsystemen in het cytoplasma van gastheercellen, zijn een belangrijke virulentie onderdeel dat vele pathogene bacteriën gebruiken om een infectie in unieke replicatieve niches stellen. De focus van veel onderzoeksgroepen is om de interactie tussen bacteriële effectoren en gastheer- en de invloed van deze effectoren hebben voor talrijke cellulaire routes onderzocht. Zeer weinig onderzoek, eventueel, de mogelijkheid van gastheereiwitten noodzakelijk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.
Materials
| Reagents | |||
| Citric acid | Sigma | C0759 | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218 | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Calbiochem | 442611 | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Fisher | S93248 | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852 | ACCM-2 medium component |
| Bacto-neopeptone | BD | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | Fisher | BP1424 | ACCM-2 medium component |
| Methyl beta cyclodextrin | Sigma | C4555 | ACCM-2 medium component |
| RPMI + Glutamax | ThermoFisher Scientific | 61870-036 | ACCM-2 medium component |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | For bacterial culture |
| ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) | Dharmacon | D-001810-10-05 | Non-targeting control |
| siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-003290-01-005 | Causes cell death; measure of transfection efficiency |
| siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-004009-00-0005 | |
| siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-010388-00-0005 | |
| 5X siRNA buffer | Dharmacon | B-002000-UB-100 | Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer |
| DharmaFECT-1 Transfection Reagent | Dharmacon | T-2001-01 | For transfection |
| Opti-MEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | Reduced-serum medium used for transfection |
| DMEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10567-014 | For cell culture and infection |
| Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Can use alternate equivalent product |
| DMSO | Sigma | D8418 | For storage of Coxiella strain |
| PBS | For cell culture | ||
| 0.05% Trypsin + EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | For cell culture |
| dH2O | For dilution of samples and standards for qPCR | ||
| Quick-gDNA Mini Prep | ZYMO Research | D3007 | Can use alternate equivalent product to extract gDNA |
| SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Bioline | BIO-98020 | Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM | Invitrogen | K1032 | For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO) |
| Sodium hydroxide | Merck | 106469 | Probenicid solution component |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | 71505 | Probenicid solution component |
| di-Sodium hydrogen orthophosphate | Merck | 106586 | Probenicid solution component |
| Probenicid | Sigma | P8761 | Probenicid solution component |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62251 | Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. |
| 4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS | Sigma | P6148 | Fixing solution for HeLa 229 cells |
| 25cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430639 | For growth of bacterial strain |
| 96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 3603 | |
| 75cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430641 | For growth of HeLa 229 cells |
| 175cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 431080 | For growth of HeLa 229 cells |
| Haemocytometer | For quantification of HeLa 229 cells | ||
| Tear-A-Way 96 Well PCR plates | 4titude | 4ti-0750/TA | For qPCR reaction |
| 8-Lid chain, flat | Sarstedt | 65.989.002 | For qPCR reaction |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bench top microfuge | |||
| Bench top vortex | |||
| Orbital mixer | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | For pelleting bacterial culture |
| Nanodrop | For gDNA quantification | ||
| Mx3005P QPCR machine | Aligent Technologies | 401456 | For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture |
| ClarioSTAR microplate reader | BMG LabTech | For measurement of fluorescence |
Riferimenti
- Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
- Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
- van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
- Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
- Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
- Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
- Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
- Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
- Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
- Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
- Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
- Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
- Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
- Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
- Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
- Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
- Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
- Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
- Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella’burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
- Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
- Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
- Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
- Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
- Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
- Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
- Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
- Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
- de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
- Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
- Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
- Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
- Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
- Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
- Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
- McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
- Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
- Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
- Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
- Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).
