Application Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour examiner effecteur translocation efficacité par<em> Coxiella burnetii</em> Pendant siRNA Silencing
Summary
L'étude des interactions entre les bactéries pathogènes et leurs hôtes est un domaine important de la recherche biologique. Ici, nous décrivons les techniques nécessaires pour mesurer la translocation effecteur par Coxiella burnetii lors de l' inactivation de gène siRNA en utilisant un substrat BlaM.
Abstract
Coxiella burnetii, l'agent causal de la fièvre Q, est un pathogène intracellulaire qui repose sur un type IV Dot / Icm Système Sécrétion d'établir une niche réplicative. Une cohorte de effecteurs sont transloqué à travers ce système dans la cellule hôte pour manipuler les processus d'accueil et de permettre l'établissement d'une vacuole lysosome dérivé unique pour la réplication. La méthode présentée ici implique la combinaison de deux techniques bien établies: silençage génique spécifique en utilisant le siRNA et la mesure de la translocation d'effecteur au moyen d'un substrat à base de FRET qui repose sur l'activité β-lactamase. L'application de ces deux approches, nous pouvons commencer à comprendre le rôle des facteurs de l'hôte en fonction du système de sécrétion bactérienne et effecteur translocation. Dans cette étude, nous avons examiné le rôle de RAB5A et Rab7A, à la fois des régulateurs importants de la voie de trafic endocytose. On démontre que l'inhibition de l'expression d'un des deux protéines à une diminution effecteur translocation efficacité. Ces méthodes peuvent être facilement modifiés pour examiner d'autres pathogènes intracellulaires et extracellulaires qui utilisent également des systèmes de sécrétion. De cette manière, une image globale des facteurs de l'hôte impliqués dans la translocation bactérienne effecteur peut être révélée.
Introduction
Coxiella burnetii est un pathogène intracellulaire unique qui provoque la zoonotique infection humaine fièvre Q. Cette maladie est associée à un large éventail de présentations cliniques s'étendant de séroconversion asymptomatique à une infection chronique potentiellement mortelle qui se manifeste souvent endocardite ans après l' exposition 1. L'infection humaine se produit principalement par l'inhalation d'aérosols contaminés avec ruminants le principal réservoir d'infection, en particulier, les vaches laitières, les moutons et les chèvres. Bien que l' infection Coxiella chez ces animaux est généralement subclinique, l'infection peut déclencher l' avortement et la charge bactérienne considérable dans le fluide de l' accouchement et le placenta peut contaminer l'environnement local 1. Un exemple de l'énorme fardeau telle contamination peut avoir sur la santé publique et l'industrie de l' agriculture a récemment été observée dans l'épidémie de fièvre Q qui a eu lieu aux Pays – Bas 2. Entre 2007 et2010, plus de 4000 cas humains de fièvre Q ont été diagnostiqués et cette épidémie était liée à une contamination importante des exploitations caprines 3. En outre, Coxiella est une arme biologique potentielle, classé par les US Centers for Disease Control and Prevention, en raison de la stabilité de l' environnement des bactéries et une faible dose infectieuse nécessaire pour provoquer la morbidité et de la mortalité 4 sévère.
Coxiella existe en deux phases: Phase I organismes, isolées à partir de sources naturelles, sont extrêmement virulents et les organismes de la Phase II sont fortement atténués in vivo. Par exemple, après quelques passages in vitro dans des Coxiella burnetii phase I Nine Mile organismes, les bactéries de phase II ont été produits qui contiennent une délétion chromosomique irréversible résultant en un lipopolysaccharide tronqué (LPS) 5. Cette souche, C. burnetii NMII, est phénotypiquement similaire à la phase I dans les modèles de culture de tissus et fournit un mode plus sûrl pour les chercheurs pour étudier la pathogenèse Coxiella dans les laboratoires 5. Au cours des dernières années , plusieurs avancées ont rapidement fait progresser le domaine de la génétique Coxiella. Plus particulièrement, le développement des médias axénique (acidifié milieu de cystéine citrate – ACCM-2) a permis la croissance sans cellule de Coxiella à la fois liquide et sur des supports solides 6,7. Cela a entraîné des améliorations directes des outils génétiques disponibles pour Coxiella , y compris un système d'expression génique inductible, des vecteurs navettes et des systèmes de transposon aléatoires 8-11. Plus récemment, deux méthodes d'inactivation du gène ciblé ont également été mis au point, ouvrant la voie à l' examen des gènes candidats de virulence spécifiques 12.
Après intériorisation par les macrophages alvéolaires, Coxiella réplique à un nombre élevé dans un compartiment lié à la membrane appelée Coxiella- contenant des vacuoles (CCV). Le CCV nécessite le trafic d'endocytose hôte eendosomes précoces et tardives rugueux jusqu'à ce qu'il arrive à maturité dans un organite lysosome dérivé 13. Tout au long de ce processus, le CCV acquiert des facteurs hôtes qui soit apparaissent transitoirement ou restent associés à la vacuole, y compris, mais sans s'y limiter, Rab5, Rab7, CD63 et LAMP-13 à 15 janvier. Réplication de Coxiella dans les cellules hôtes est entièrement dépendante d' un type Dot / Icm système entièrement fonctionnel IVB Sécrétion (T4SS) 8,16,17. Ce système de sécrétion est une structure multi-protéique héréditairement liés aux systèmes de conjugaison et englobe à la fois les membranes bactériennes et vacuolaires pour délivrer des protéines bactériennes, appelées effecteurs, dans le cytoplasme de l' hôte 18. Le Coxiella T4SS est fonctionnellement très similaire au type IVB Dot / Icm système Sécrétion bien caractérisé de Legionella pneumophila 19,20. Fait intéressant, l' activation de l'effecteur translocation T4SS et ultérieure ne se produit pas jusqu'à ce que Coxiella atteint le lysosome dérivé acideorganite, environ 8 heures post-infection 17,21. À ce jour, plus de 130 effecteurs Dot / Icm ont été identifiés 9,17,22-24. Beaucoup de ces effecteurs jouent probablement un rôle important lors de la réplication de Coxiella dans les cellules hôtes; cependant, seuls quelques effecteurs ont été caractérisées fonctionnellement 25-29.
Dans cette étude , nous utilisons une translocation dosage par fluorescence à base qui repose sur le clivage du substrat FRET CCF2-AM (ci – après dénommé le substrat BlaM) via l' activité β-lactamase dans le cytoplasme de la cellule hôte (figure 1). Le gène d'intérêt est fusionnée à TEM-1 β-lactamase (BlaM) sur un plasmide rapporteur qui permet une expression constitutive. Le substrat BlaM est composé de deux fluorophores (coumarine et fluorescéine) qui forment une paire FRET. L'excitation des résultats de la coumarine dans la case de la fluorescéine et le vert émission de fluorescence en l'absence d'effecteur translocation; cependant, si le BlaM effecteur protéine de fusion subit une translocation dans le cytoplasme de l'hôte, la résultante β-lactamase activité clive la bague β-lactame du substrat BlaM, séparant la paire de FRET produisant une émission de fluorescence bleue après excitation. Ce test de translocation a été éprouvée comme une approche pour identifier les protéines effectrices à partir d' une gamme de différentes bactéries intracellulaires et extracellulaires, y compris C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, entéropathogènes E. coli, Salmonella et Brucella 17,30-35.
Pour déterminer le rôle des facteurs de l' hôte spécifiques sur Coxiella effecteur translocation nous utilisons une méthode bien établie pour l' inactivation de gène connu comme l' interférence ARN, en particulier les petits ARN interférents (siRNA). Initialement identifié dans Caenorhabditis elegans, l' interférence ARN est un processus cellulaire endogène conservé utilisé pour defe innéense contre les virus, ainsi que régulation des gènes 36,37. Après la liaison de siRNA spécifique de la séquence, la dégradation de l' ARNm se produit à travers RISC (complexe taire induite par l' ARN) conduisant à l' inactivation de gène spécifique ou knockdown 38. Dans cette étude, l'ARNsi a été utilisé pour cibler deux protéines de l'hôte, et RAB5A Rab7A, qui sont des régulateurs importants de la voie d'endocytose. L'impact du silence RAB5A et Rab7A sur effecteur translocation a été établie à l' aide C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 a été choisi car il a été montré précédemment translocation par le système de sécrétion de point / Icm de Coxiella 17.
Utilisant à la fois siRNA silençage génique et le test de translocation fluorescencebased décrit ici, nous commençons à établir un rôle de facteurs de l' hôte dans la translocation des protéines effectrices par Coxiella. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de bactéries intracellulaires et extracellulaires qui possèdent secretio similairesLes systèmes responsables de la translocation de protéines effectrices n.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les systèmes de sécrétion, et les protéines effectrices bactériennes ces systèmes de transport dans le cytoplasme des cellules hôtes sont une composante importante de virulence que de nombreuses bactéries pathogènes utilisent pour établir une infection dans des niches réplicatives uniques. L'objectif de nombreux groupes de recherche a été d'étudier l'interaction entre les effecteurs bactériens et protéines de l'hôte et l'influence de ces effecteurs ont sur les voies cellulaires hôte…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.
Materials
| Reagents | |||
| Citric acid | Sigma | C0759 | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218 | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Calbiochem | 442611 | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Fisher | S93248 | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852 | ACCM-2 medium component |
| Bacto-neopeptone | BD | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | Fisher | BP1424 | ACCM-2 medium component |
| Methyl beta cyclodextrin | Sigma | C4555 | ACCM-2 medium component |
| RPMI + Glutamax | ThermoFisher Scientific | 61870-036 | ACCM-2 medium component |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | For bacterial culture |
| ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) | Dharmacon | D-001810-10-05 | Non-targeting control |
| siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-003290-01-005 | Causes cell death; measure of transfection efficiency |
| siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-004009-00-0005 | |
| siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-010388-00-0005 | |
| 5X siRNA buffer | Dharmacon | B-002000-UB-100 | Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer |
| DharmaFECT-1 Transfection Reagent | Dharmacon | T-2001-01 | For transfection |
| Opti-MEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | Reduced-serum medium used for transfection |
| DMEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10567-014 | For cell culture and infection |
| Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Can use alternate equivalent product |
| DMSO | Sigma | D8418 | For storage of Coxiella strain |
| PBS | For cell culture | ||
| 0.05% Trypsin + EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | For cell culture |
| dH2O | For dilution of samples and standards for qPCR | ||
| Quick-gDNA Mini Prep | ZYMO Research | D3007 | Can use alternate equivalent product to extract gDNA |
| SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Bioline | BIO-98020 | Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM | Invitrogen | K1032 | For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO) |
| Sodium hydroxide | Merck | 106469 | Probenicid solution component |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | 71505 | Probenicid solution component |
| di-Sodium hydrogen orthophosphate | Merck | 106586 | Probenicid solution component |
| Probenicid | Sigma | P8761 | Probenicid solution component |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62251 | Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. |
| 4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS | Sigma | P6148 | Fixing solution for HeLa 229 cells |
| 25cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430639 | For growth of bacterial strain |
| 96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 3603 | |
| 75cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430641 | For growth of HeLa 229 cells |
| 175cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 431080 | For growth of HeLa 229 cells |
| Haemocytometer | For quantification of HeLa 229 cells | ||
| Tear-A-Way 96 Well PCR plates | 4titude | 4ti-0750/TA | For qPCR reaction |
| 8-Lid chain, flat | Sarstedt | 65.989.002 | For qPCR reaction |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bench top microfuge | |||
| Bench top vortex | |||
| Orbital mixer | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | For pelleting bacterial culture |
| Nanodrop | For gDNA quantification | ||
| Mx3005P QPCR machine | Aligent Technologies | 401456 | For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture |
| ClarioSTAR microplate reader | BMG LabTech | For measurement of fluorescence |
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