Bruk av Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) for å undersøke Effector Trans Effektivitet av<em> Coxiella burnetii</em> Under siRNA lyddemping
Summary
Gransker samspillet mellom bakterielle patogener og deres verter er et viktig område for biologisk forskning. Her beskriver vi de nødvendige teknikker for å måle effektor trans av Coxiella burnetii under siRNA genet Slå hjelp Blam underlaget.
Abstract
Coxiella burnetii, den utløsende agent for Q-feber er en intracellulær patogen som er avhengig av en type IV Dot / Icm Sekresjon System for å etablere en replicative nisje. En kohort av effektorer er translokaliseres gjennom dette systemet inn i vertscellen for å manipulere vertsprosesser, og tillate etablering av en unik lysosom-avledet vacuole for replikasjon. Metoden som presenteres her omfatter en kombinasjon av to godt etablerte teknikker: spesifikk genet Slå ved hjelp av siRNA og måling av effektoren translokasjon ved å bruke et FRET-basert substrat som er avhengig av β-laktamase-aktivitet. Bruk av disse to tilnærmingene, kan vi begynne å forstå hvilken rolle vertsfaktorer i bakterie sekresjon systemets funksjon og effektor trans. I denne studien undersøkte vi hvilken rolle Rab5A og Rab7A, både viktige regulatorer av endocytic menneskehandel veien. Vi viser at stanse ekspresjonen av enten protein resulterer i en reduksjon i effektor translocation effektivitet. Disse metodene kan enkelt endres til å undersøke andre intracellulære og ekstracellulære patogener som også utnytter sekresjon systemer. På denne måte kan et globalt bilde av vertsfaktorer som er involvert i bakteriell translokasjon effektor bli avslørt.
Introduction
Coxiella burnetii er en unik intracellulær patogen som forårsaker zoonotiske menneske-smitte Q-feber. Denne sykdommen er assosiert med et vidt spektrum av kliniske presentasjoner som strekker seg fra asymptomatisk serokonversjon til livstruende kronisk infeksjon som ofte manifesterer seg som endokarditt år etter eksponering 1. Humant infeksjon skjer først og fremst ved inhalering av aerosoler forurenset med drøvtyggere den store reservoar for infeksjon, spesielt melkekyr, sauer og geiter. Selv Coxiella infeksjon i disse dyrene er vanligvis subklinisk, kan infeksjonen utløse abort og betydelig bakteriemengden i birthing væske og morkaken kan forurense nærmiljøet en. Et eksempel på den enorme byrden slik forurensning kan ha på både folkehelsen og landbruket ble nylig observert i Q-feber utbrudd som skjedde i Nederland to. Mellom 2007 og2010 ble over 4000 menneskelige tilfeller av Q-feber diagnostisert og dette utbruddet var knyttet til betydelig forurensning av geit gårder 3. I tillegg er Coxiella en potensiell biologisk våpen, som klassifisert av US Centers for Disease Control and Prevention, på grunn av de miljømessige stabiliteten av bakterier og lav smittedose er nødvendig for å forårsake alvorlig sykdom og død fire.
Coxiella finnes i to faser: Fase I organismer, isolert fra naturlige kilder, er svært virulente og fase II organismer er sterkt svekket in vivo. For eksempel, etter flere in vitro passasjer av Coxiella burnetii Nine Mile Fase I organismer, ble Fase II bakterier produsert som inneholder en irreversibel kromosom sletting resulterer i forkortet lipopolysakkarid (LPS) 5. Denne belastningen, C. burnetii NMII, er fenotypisk lik fase I i vevskultur modeller og gir et sikrere modusl for forskere å studere Coxiella patogenesen i laboratorier 5. I de senere årene har flere gjennombrudd har raskt avanserte innen Coxiella genetikk. Mest spesielt utviklingen av axenic media (surgjort sitrat cystein medium – ACCM-2) har tillatt den cellefrie vekst av Coxiella både i flytende og på faste medier 6,7. Dette resulterte i direkte forbedringer av genetiske verktøy tilgjengelig for Coxiella inkludert en induserbar genuttrykksystem transporttjenester vektorer og tilfeldige transposon systemer 8-11. Nå nylig, har to metoder for målrettet genet inaktive også blitt utviklet, banet vei for å undersøke spesifikke virulens gen kandidater 12.
Etter internalisering av alveolære makrofager, Coxiella replikerer til høye tall innenfor et membranbundet rommet kalt Coxiella- inneholder vakuole (CCV). CCV krever verts endocytic menneskehandel thgrove tidlige og sene endosomer før den modnes inn i en lysosome-avledet organ 13. Gjennom hele denne prosessen, kjøper CCV vertsfaktorer som enten vises forbigående eller forbli knyttet til vakuole, inkludert, men ikke begrenset til, Rab5, Rab7, CD63 og LAMP-13 til 15 januar. Replikering av Coxiella innenfor vertsceller er helt avhengig av et fullt funksjonelt Dot / Icm Type IVB Sekresjon System (T4SS) 8,16,17. Dette sekret system er et multi-proteinstruktur slektsmessig relatert til konjugering systemer og strekker seg over både bakterielle og vacuolar membraner for å levere bakterielle proteiner, betegnet effektorer, i verten cytoplasma 18. Den Coxiella T4SS er funksjonelt svært lik den godt karakterisert Type IVB Dot / Icm Sekresjon System of Legionella pneumophila 19,20. Interessant, aktivering av T4SS og påfølgende effektor trans ikke skje før Coxiella når den sure lysosomet-avlededeorganelle, ca 8 timer etter infeksjon 17,21. Hittil har over 130 Dot / ICM effektorer blitt identifisert 9,17,22-24. Mange av disse effektorer sannsynlig spiller viktige roller under replikering av Coxiella innenfor vertsceller; men har bare noen få effektorer blitt funksjonelt preget 25-29.
I denne studien benytter vi en fluorescens-basert assay translokasjon som er avhengig av spalting av CCF2-AM FRET substrat (heretter referert til som BLAM substrat) via β-laktamase-aktivitet i vertscellen cytoplasma (figur 1). Genet av interesse fusjonert til TEM-1 β-laktamase (BLAM) på en reporter plasmid som gir konstitutiv ekspresjon. Den BLAM substratet er sammensatt av to fluoroforer (kumarin og fluorescein) som danner et FRET par. Eksitasjon av kumarin resulterer i FRET av fluorescein og grønne fluorescensemisjonen i fravær av effektoren translokasjon; Hvis imidlertid BlaM-effektor-fusjonsprotein blir translokert inn i verts cytoplasma, den resulterende β-laktamase-aktivitet spalter β-laktam-ring av BLAM substratet, separering av FRET paret fremstilling blå fluorescens-emisjon etter eksitasjon. Denne trans analysen har blitt godt dokumentert som en tilnærming for å identifisere effektor proteiner fra en rekke forskjellige intracellulære og ekstracellulære bakterier, inklusive C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogen E. coli, Salmonella og Brucella 17,30-35.
For å finne ut hvilken rolle spesifikke vertsfaktorer på Coxiella effektor trans vi benytter en veletablert metode for genet Slå kjent som RNA-interferens, særlig små interfererende RNA (siRNA). Opprinnelig identifisert i Caenorhabditis elegans, er RNA interferens en konservert endogen cellulær prosess som brukes for medfødt defense mot virus, så vel som genregulering 36,37. Etter binding av sekvens-spesifikk siRNA, degradering av mRNA skjer gjennom RISC (RNA-induced Slå kompleks) som resulterer i spesifikke genet Slå eller knockdown 38. I denne studien ble siRNA brukes til å målrette to verts proteiner, Rab5A og Rab7A, som er viktige regulatorer av endocytoseveien. Virkningen av stanse Rab5A og Rab7A på effektor trans ble konstatert ved hjelp av C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 ble valgt som det var tidligere vist seg å være translocated av Dot / Icm sekresjon system av Coxiella 17.
Utnytte både siRNA genet Slå og fluorescencebased trans analysen beskrevet her, er vi i ferd med å etablere en rolle for vertsfaktorer i trans av effektor proteiner ved Coxiella. Denne tilnærmingen kan brukes på et stort utvalg av både intracellulære og ekstracellulære bakterier som innehar lignende secretion-systemer som er ansvarlig for translokasjon av effektor proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sekresjon systemer, og de bakterielle effektor proteiner disse systemene transport inn i cytoplasma av vertsceller, er en viktig virulens komponent som mange patogene bakterier benytter for å etablere en infeksjon i unike replikative nisjer. Fokus for mange forskningsgrupper har vært å undersøke samspillet mellom bakterielle effektorer og verts proteiner og innflytelsen disse effektorer har på vertscelle veier. Meget begrenset forskning, om noen, har undersøkt muligheten for vertsproteiner for å være nødvendig …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.
Materials
| Reagents | |||
| Citric acid | Sigma | C0759 | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218 | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Calbiochem | 442611 | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Fisher | S93248 | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852 | ACCM-2 medium component |
| Bacto-neopeptone | BD | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | Fisher | BP1424 | ACCM-2 medium component |
| Methyl beta cyclodextrin | Sigma | C4555 | ACCM-2 medium component |
| RPMI + Glutamax | ThermoFisher Scientific | 61870-036 | ACCM-2 medium component |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | For bacterial culture |
| ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) | Dharmacon | D-001810-10-05 | Non-targeting control |
| siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-003290-01-005 | Causes cell death; measure of transfection efficiency |
| siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-004009-00-0005 | |
| siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-010388-00-0005 | |
| 5X siRNA buffer | Dharmacon | B-002000-UB-100 | Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer |
| DharmaFECT-1 Transfection Reagent | Dharmacon | T-2001-01 | For transfection |
| Opti-MEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | Reduced-serum medium used for transfection |
| DMEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10567-014 | For cell culture and infection |
| Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Can use alternate equivalent product |
| DMSO | Sigma | D8418 | For storage of Coxiella strain |
| PBS | For cell culture | ||
| 0.05% Trypsin + EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | For cell culture |
| dH2O | For dilution of samples and standards for qPCR | ||
| Quick-gDNA Mini Prep | ZYMO Research | D3007 | Can use alternate equivalent product to extract gDNA |
| SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Bioline | BIO-98020 | Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM | Invitrogen | K1032 | For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO) |
| Sodium hydroxide | Merck | 106469 | Probenicid solution component |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | 71505 | Probenicid solution component |
| di-Sodium hydrogen orthophosphate | Merck | 106586 | Probenicid solution component |
| Probenicid | Sigma | P8761 | Probenicid solution component |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62251 | Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. |
| 4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS | Sigma | P6148 | Fixing solution for HeLa 229 cells |
| 25cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430639 | For growth of bacterial strain |
| 96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 3603 | |
| 75cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430641 | For growth of HeLa 229 cells |
| 175cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 431080 | For growth of HeLa 229 cells |
| Haemocytometer | For quantification of HeLa 229 cells | ||
| Tear-A-Way 96 Well PCR plates | 4titude | 4ti-0750/TA | For qPCR reaction |
| 8-Lid chain, flat | Sarstedt | 65.989.002 | For qPCR reaction |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bench top microfuge | |||
| Bench top vortex | |||
| Orbital mixer | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | For pelleting bacterial culture |
| Nanodrop | For gDNA quantification | ||
| Mx3005P QPCR machine | Aligent Technologies | 401456 | For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture |
| ClarioSTAR microplate reader | BMG LabTech | For measurement of fluorescence |
Riferimenti
- Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
- Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
- van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
- Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
- Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
- Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
- Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
- Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
- Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
- Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
- Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
- Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
- Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
- Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
- Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
- Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
- Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
- Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
- Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella’burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
- Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
- Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
- Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
- Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
- Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
- Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
- Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
- Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
- de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
- Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
- Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
- Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
- Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
- Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
- Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
- McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
- Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
- Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
- Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
- Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).
