Tillämpa Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) för att undersöka Effector Trans Effektivitet av<em> Coxiella burnetii</em> Under siRNA Ljuddämpning
Summary
Undersöker samspelet mellan bakteriella patogener och deras värdar är ett viktigt område för biologisk forskning. Här beskriver vi de nödvändiga tekniker för att mäta effektor translokation av Coxiella burnetii under siRNA geners uttryck med hjälp av BLAM substrat.
Abstract
Coxiella burnetii, det orsakande medlet av Q-feber, är en intracellulär patogen som förlitar sig på en typ IV Dot / Icm sekretionssystemet för att etablera en replika nisch. En kohort av effekten translokeras genom detta system i värdcellen för att manipulera värdprocesser och möjliggöra inrättandet av en unik lysosom härrörande vacuole för replikering. Den metod som presenteras här innebär en kombination av två väletablerade metoder: specifik geners uttryck med hjälp av siRNA och mätning av effektor sloka med hjälp av en FRET-baserad substrat som bygger på β-laktamasaktivitet. Tillämpa dessa två metoder, kan vi börja att förstå vilken roll värdfaktorer i bakteriell sekretionssystemet funktion och effektor translokation. I denna studie undersökte vi roll Rab5A och Rab7A, både viktiga regulatorer av den endocytiska handel vägen. Vi visar att tysta uttrycket av antingen protein resulterar i en minskning av effektor translocation effektivitet. Dessa metoder kan lätt modifieras för att undersöka andra intracellulära och extracellulära patogener som också utnyttjar sekretionssystem. På detta sätt kan en global bild av värdfaktorer som är involverade i bakteriell effektor transloka avslöjas.
Introduction
Coxiella burnetii är en unik intracellulär patogen som orsakar zoonotiska mänsklig infektion Q-feber. Denna sjukdom är förknippad med ett brett spektrum av kliniska presentationer som sträcker sig från asymtomatisk serokonversion till livshotande kronisk infektion som ofta manifesteras som endokardit år efter exponering 1. Mänsklig infektion sker främst genom inandning av kontaminerade aerosoler med idisslare huvud reservoar för infektion, i synnerhet mjölkkor, får och getter. Även Coxiella infektion i dessa djur är vanligtvis subklinisk, kan infektionen leda abort och betydande bakteriehalten i förlossningsvätskan och moderkakan kan förorena den lokala miljön en. Ett exempel på den enorma börda sådan förorening kan ha på både folkhälsan och jordbruksindustrin har nyligen observerats i Q-feber utbrott som inträffade i Nederländerna 2. Mellan 2007 och2010, över 4000 mänskliga fall av Q-feber diagnostiserades och detta utbrott var kopplat till betydande förorening av getgårdar 3. Dessutom är Coxiella en potentiell biologiskt vapen, enligt klassificeringen av de amerikanska Centers for Disease Control and Prevention, på grund av miljö stabiliteten hos bakterier och låg smitt dos som krävs för att orsaka allvarlig sjuklighet och dödlighet 4.
Coxiella förekommer i två faser: Fas I organismer, isolerade från naturliga källor, är extremt virulent och fas II organismer är mycket försvagade in vivo. Till exempel, efter flera in vitro-passager av Coxiella burnetii Nine Mile fas I organismer har fas II bakterier produceras som innehåller en irreversibel kromosom deletion resulterar i stympad lipopolysackarid (LPS) 5. Denna stam, C. burnetii NMII är fenotypiskt liknar fas I i vävnadskulturmodeller och ger en säkrare lägel för forskare att studera Coxiella patogenes i laboratorier 5. Under senare år har flera genombrott har snabbt avancerat inom Coxiella genetik. Framför allt utvecklingen av axenisk media (surgjord citrat cystein medel – ACCM-2) har gjort det cellfria tillväxt Coxiella i både flytande och fasta medier 6,7. Detta resulterade i direkta förbättringar av genetiska verktyg för Coxiella inklusive en inducerbar genuttryck systemet, skyttelvektorer och slumpmässiga transposonmutanter system 8-11. Senast har två metoder för riktad gen inaktive också tagits fram, vilket banar väg för att undersöka specifika virulensgen kandidater 12.
Efter internalisering av alveolära makrofager, replikerar Coxiella höga siffror inom en membranbundna fack kallas Coxiella- innehållande vakuolen (CCV). CCV kräver värd endocytiska handel thgrov tidiga och sena endosomer tills den mognar till en lysosom härrörande organell 13. Under hela denna process, CCV förvärvar värdfaktorer som antingen visas övergående eller förbli associerade med vakuolen, inklusive, men inte begränsat till, Rab5, Rab7, CD63 och LAMP-13-15 januari. Replikering av Coxiella inom värdceller är helt beroende av en fullt fungerande Dot / Icm typ IVB sekretionssystemet (T4SS) 8,16,17. Denna sekretionssystemet är en multi-proteinstruktur ancestrally relaterade till konjugering system och sträcker sig över båda bakteriella och vakuolära membran för att leverera bakteriella proteiner, benämnda effektorer, in i värd cytoplasman 18. Den Coxiella T4SS är funktionellt mycket lik den väl karakteriserade typ IVB Dot / Icm Sekretion System of Legionella pneumophila 19,20. Intressant, inte aktivering av T4SS och efterföljande effektor translokation inte ske förrän Coxiella når den sura lysosom-härleddaorganell, ungefär 8 h efter infektion 17,21. Hittills har mer än 130 punkter / Icm effektenheter identifierats 9,17,22-24. Många av dessa effektenheter spelar troligen en viktig roll vid replikering av Coxiella inom värdceller; har dock endast ett fåtal effektorer funktionellt karaktäriseras 25-29.
I denna studie använder vi en fluorescensbaserad sloka analys som förlitar sig på klyvning av CCF2-AM FRET-substrat (i det följande kallat BLAM substrat) via β-laktamasaktivitet inuti värdcellen cytoplasma (Figur 1). Genen av intresse är sammansmält med TEM-1 β-laktamas (BLAM) på en reporterplasmid som ger konstitutiv expression. Den BLAM substrat är sammansatt av två fluoroforer (kumarin och fluorescein) som bildar ett FRET-par. Excitation av kumarinresulterar i FRET av fluorescein och grönt fluorescensemission i frånvaro av effektorn sloka; Men om den BlaM-effektor-fusionsproteinet translokeras in i värd cytoplasman, den erhållna β-laktamasaktivitet spaltar β-laktamringen av BLAM substrat, separering av FRET paret producerar blå fluorescensemission efter excitering. Denna translokation analys har väl beprövade som en metod för att identifiera effektor proteiner från en rad olika intracellulära och extracellulära bakterier, inklusive C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogen E. coli, Salmonella och Brucella 17,30-35.
För att bestämma betydelsen av specifika värdfaktorer på Coxiella effektor sloka vi använder en väletablerad metod för geners uttryck kallas RNA-interferens, i synnerhet små störande RNA (siRNA). Ursprungligen identifieras i Caenorhabditis elegans, är RNA-interferens en bevarad endogen cellulär process som används för medfödda defeNSE mot virus samt genreglering 36,37. Efter bindning av sekvensspecifik siRNA sker nedbrytning av mRNA genom RISC (RNA-inducerad tysta komplex) som resulterar i specifik geners uttryck eller knockdown 38. I denna studie var siRNA används för att rikta två värdproteiner, Rab5A och Rab7A, som är viktiga regulatorer av den endocytiska vägen. Effekterna av ljuddämpnings Rab5A och Rab7A på effektor translokation fastställdes med hjälp av C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 valdes som det tidigare visat sig vara translokeras av Dot / Icm sekretionssystem av Coxiella 17.
Med hjälp av både siRNA geners uttryck och fluorescensbaserad translokation analysen beskrivs här, börjar vi att etablera en roll för värdfaktorer i translokation av effektor proteiner av Coxiella. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas på ett brett spektrum av både intracellulära och extracellulära bakterier som besitter liknande secretion system som ansvarar för translokation av effektorceller proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sekretionssystem, och bakterie effektorproteiner dessa transportsystem i cytoplasman i värdceller, är en viktig virulens komponent som många patogena bakterier använder för att etablera en infektion inom unika replikativa nischer. Fokus för många forskargrupper har varit att undersöka samspelet mellan bakterieeffektenheter och värdproteiner och påverkar dessa effektenheter har på värd cellulära vägar. Mycket begränsad forskning, om någon, har undersökt möjligheten för värdproteiner vara nödvändigt …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.
Materials
| Reagents | |||
| Citric acid | Sigma | C0759 | ACCM-2 medium component |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | ACCM-2 medium component |
| Potassium phosphate | Sigma | 60218 | ACCM-2 medium component |
| Magnesium chloride | Calbiochem | 442611 | ACCM-2 medium component |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | ACCM-2 medium component |
| Iron sulfate | Fisher | S93248 | ACCM-2 medium component |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | ACCM-2 medium component |
| L-cysteine | Sigma | C6852 | ACCM-2 medium component |
| Bacto-neopeptone | BD | 211681 | ACCM-2 medium component |
| Casamino acids | Fisher | BP1424 | ACCM-2 medium component |
| Methyl beta cyclodextrin | Sigma | C4555 | ACCM-2 medium component |
| RPMI + Glutamax | ThermoFisher Scientific | 61870-036 | ACCM-2 medium component |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | For bacterial culture |
| ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP) | Dharmacon | D-001810-10-05 | Non-targeting control |
| siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-003290-01-005 | Causes cell death; measure of transfection efficiency |
| siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-004009-00-0005 | |
| siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA – SMARTpool | Dharmacon | M-010388-00-0005 | |
| 5X siRNA buffer | Dharmacon | B-002000-UB-100 | Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer |
| DharmaFECT-1 Transfection Reagent | Dharmacon | T-2001-01 | For transfection |
| Opti-MEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | Reduced-serum medium used for transfection |
| DMEM + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10567-014 | For cell culture and infection |
| Heat-inactivated fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Can use alternate equivalent product |
| DMSO | Sigma | D8418 | For storage of Coxiella strain |
| PBS | For cell culture | ||
| 0.05% Trypsin + EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | For cell culture |
| dH2O | For dilution of samples and standards for qPCR | ||
| Quick-gDNA Mini Prep | ZYMO Research | D3007 | Can use alternate equivalent product to extract gDNA |
| SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Bioline | BIO-98020 | Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM | Invitrogen | K1032 | For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO) |
| Sodium hydroxide | Merck | 106469 | Probenicid solution component |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | 71505 | Probenicid solution component |
| di-Sodium hydrogen orthophosphate | Merck | 106586 | Probenicid solution component |
| Probenicid | Sigma | P8761 | Probenicid solution component |
| DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62251 | Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS. |
| 4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS | Sigma | P6148 | Fixing solution for HeLa 229 cells |
| 25cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430639 | For growth of bacterial strain |
| 96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 3603 | |
| 75cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 430641 | For growth of HeLa 229 cells |
| 175cm2 tissue culture flask with vented cap | Corning | 431080 | For growth of HeLa 229 cells |
| Haemocytometer | For quantification of HeLa 229 cells | ||
| Tear-A-Way 96 Well PCR plates | 4titude | 4ti-0750/TA | For qPCR reaction |
| 8-Lid chain, flat | Sarstedt | 65.989.002 | For qPCR reaction |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Bench top microfuge | |||
| Bench top vortex | |||
| Orbital mixer | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | For pelleting bacterial culture |
| Nanodrop | For gDNA quantification | ||
| Mx3005P QPCR machine | Aligent Technologies | 401456 | For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture |
| ClarioSTAR microplate reader | BMG LabTech | For measurement of fluorescence |
Riferimenti
- Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
- Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
- van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
- Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
- Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
- Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
- Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
- Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
- Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
- Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
- Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97 (2011).
- Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
- Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
- Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
- Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
- Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056 (2011).
- Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
- Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
- Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella’burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
- Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566 (2013).
- Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
- Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
- Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
- Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
- Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
- Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
- Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117 (2008).
- de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
- Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
- Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
- Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
- Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252 (2015).
- Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013 (2014).
- Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
- McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
- Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
- Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
- Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
- Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).
