Analisi di Brain mitocondri Utilizzando Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy
Summary
Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.
Abstract
Il cervello umano è un alto organo consumare energia che si basa principalmente su glucosio come fonte di combustibile. Il glucosio è catabolizzata dai mitocondri cerebrali tramite percorsi glicolisi, acido tri-carbossilico (TCA) ciclo e fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per produrre energia cellulare sotto forma di adenosina trifosfato (ATP). Perdite di valore di produzione di ATP mitocondriale provoca disturbi mitocondriali, che presentano clinicamente con sintomi neurologici e miopatici prominenti. Difetti mitocondriali sono presenti in disturbi dello sviluppo neurologico (ad esempio disturbo dello spettro autistico) e disturbi neurodegenerativi anche (ad esempio, sclerosi laterale amiotrofica, il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson). Quindi, vi è un crescente interesse nel campo per l'esecuzione di analisi 3D mitocondriale morfologia, struttura e distribuzione sotto entrambi gli stati sani e malattia. La morfologia mitocondriale cervello è estremamente variegato, con alcuni mitocondri specialmente quelliregione sinaptica essendo nell'intervallo <200 nm di diametro, che è inferiore al limite di risoluzione della microscopia ottica tradizionale. Esprimendo una proteina mitocondrialmente mirati verde fluorescente (GFP) nel cervello migliora in modo significativo la rilevazione organelli mediante microscopia confocale. Tuttavia, non supera i vincoli sulla sensibilità di rilevazione dei mitocondri relativamente piccole dimensioni senza sovra- saturazione delle immagini di grandi dimensioni mitocondri. Mentre microscopia elettronica a trasmissione di serie è stato utilizzato con successo per caratterizzare i mitocondri alla sinapsi neuronali, questa tecnica è notevole spreco di tempo soprattutto quando si confrontano campioni multipli. La tecnica di blocco faccia microscopia elettronica a scansione seriale (SBFSEM) comporta un processo automatizzato di sezionamento, blocchi di imaging di acquisizione dei tessuti e dei dati. Qui, forniamo un protocollo per eseguire SBFSEM di una regione definita da roditore cervello per ricostruire rapidamente e visualizzare la morfologia mitocondriale. questa tecnologianique potrebbe anche essere utilizzato per fornire informazioni accurate sul numero mitocondriale, volume, dimensione e distribuzione in una regione del cervello definito. Dal momento che la risoluzione dell'immagine ottenuta è elevata (in genere sotto i 10 nm) possono essere rilevati anche gli eventuali difetti morfologici mitocondriali lordi.
Introduction
I mitocondri sono organelli dinamici che cambiano la loro forma e la posizione a seconda delle esigenze spunti e cellulari, in stretta interazione con citoscheletro cellulare, e in risposta ad eventi cellulari come correnti di calcio nei neuroni 1. I mitocondri interagiscono anche con altri organelli cellulari ad esempio reticolo endoplasmatico, che a sua volta regola la loro dinamica e metabolismo 2. Morfologia mitocondriale mostra eterogeneità in diversi tipi di cellule ad esempio. la forma del organello varia da tubolare costituita dai fogli, sacchi e ovali 3. E 'stato dimostrato che mitocondriali fusione e fissione proteine del ciclo possono regolare la posizione, dimensione, forma e distribuzione dei mitocondri 4. Inoltre, cambiamenti di forma mitocondriale sono associati a neurodegenerazione, plasticità neuronale, atrofia muscolare, la segnalazione di calcio, specie reattive dell'ossigeno generazione così come la durata della vita e la morte cellulare implicando thacellule T specifiche per la morfologia mitocondriale è fondamentale per il mantenimento della normale funzione cellulare 5-11.
Una delle principali funzioni bioenergetico dei mitocondri è generare adenosina trifosfato (ATP) eseguendo una serie di reazioni metaboliche che coinvolgono ripartizione completa dei nutrienti (cioè glucosio, acidi grassi o amminoacidi) tramite il ciclo TCA e OXPHOS percorsi 12. Il cervello umano costituisce solo il 2% del peso corporeo tuttavia consuma ~ 20% del totale dell'energia prodotta che lo rende estremamente energia esigente organo 13. È quindi sorprendente che la disfunzione mitocondriale nell'uomo conduce a un gran numero di manifestazioni neurologiche 14-17. Le mutazioni genetiche nei componenti OXPHOS che compromettono porta ATP generazione di disturbi mitocondriali 17,18, che sono gruppo clinicamente eterogeneo di disordini con una prevalenza di ~ 1: 5.000 individui, e una delle cause più comune di mdisturbi etabolic nei bambini e negli adulti. Deficit di ATP mitocondriale di derivazione colpisce di più sistemi di organo con gli organi che richiedono alta energia, come cervello, cuore e muscoli scheletrici essendo prevalentemente colpite in questi pazienti 14,17,18. Negli ultimi anni, diversi studi hanno fornito evidenza di disfunzione mitocondriale in entrambi i disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerative 15-17,19,20. Dal momento che i mitocondri sono essenziali e fondamentali per lo sviluppo e la funzione del cervello, è imperativo sviluppare protocolli in grado di analizzare i cambiamenti nel cervello mitocondriale morfologia, la struttura, le dimensioni, il numero e la distribuzione sotto entrambi gli stati sani e malati. Modelli murini con mitocondri mirati proteina fluorescente verde (GFP) sono stati prodotti di visualizzare i movimenti mitocondriali e la localizzazione nel cervello 21,22. Anche se questo è uno strumento estremamente utile per esaminare la motilità mitocondriale e distribuzione generale, ci sono alcuni inconvenienti che INCLUDe risoluzione limitata e sensibilità della microscopia a fluorescenza. Questi attributi rendono difficile rintracciare le relativamente piccole dimensioni mitocondri. Allo stesso modo, microscopia elettronica a trasmissione di serie è stato utilizzato con successo per visualizzare mitocondri sinaptica 23, ma questo metodo è molto tempo. La morfologia mitocondriale è noto per essere altamente dinamico come subiscono cicli di fissione e fusione continui, e nella maggior parte delle cellule mitocondri mantenere una rete altamente connessa 24-26. I neuroni sono altamente cellule con più dendriti e assoni estese, e mitocondri che formano una rete reticolare collegato nel corpo cellulare polarizzato può avere per separare come si fanno strada attraverso questi neuriti (Figura 1). Questo rende i mitocondri cerebrali estremamente vari per forma e dimensioni. Ad esempio, utilizzando la microscopia elettronica a scansione blocco faccia seriale (SBFSEM) tecnica, abbiamo precedentemente osservato che la differenza di volume o dimensioni mitochondr extrasinapticaia ai mitocondri presenti nei terminali nervosi può essere fino a sedici piega 27.
Ci sono diversi approcci per l'esecuzione di analisi del volume 28, che comprende una sezione di serie TEM 29, nastro automatizzata raccolta ultramicrotomo SEM 30, concentrati Ion Beam SEM 31, e SBFSEM 32. L'analisi SBFSEM presenta vantaggi in quanto ha la risoluzione di fornire dati quantitativi sulla morfologica forma, dimensioni, distribuzione e numero di organelli come mitocondri nelle zone fino a 1 mm dal cervello. L'operazione tecnica è anche il meno impegnativo, con l'acquisizione dei dati e l'analisi alla portata di molti laboratori biologici che non hanno precedenti esperienze EM. L'avvento degli strumenti commerciali per la generazione di immagini di sezione simile seriali ha reso 3D analisi ultrastrutturale dei tessuti una tecnica di routine, che consente inoltre un'analisi volumetrica imparziale in modo rapido e ripetibile 28 </sup>. Il SBFSEM è stata descritta ed utilizzata nel campo della neurobiologia nel 2004 32, basato su un'idea introdotta da Leighton nel 1981 33. Diversi studi da allora hanno stabilito questa tecnica come strumento di analisi ricostruzione dei circuiti neuronali 34. Inoltre, per molti progetti di dimensioni ridotte, che fornisce analisi di ricostruzione per identificare organelli cellulari 27,35-39. Poiché, le immagini acquisite vengono derivati da bassa tensione elettroni retrodiffusione, nuovi protocolli di colorazione che combinano diverse tecniche note colorazione metalli pesanti sono stati sviluppati per aumentare la risoluzione 40.
In questo lavoro, mettiamo a disposizione un protocollo per l'utilizzo di immagini di microscopia elettronica 3D e l'analisi volumetrica dei mitocondri cerebrali in base a metodi che sono stati usati in precedenza da noi e altri 38,39,41. I metodi di tessuti post-processing utilizzati erano come precedentemente descritto da Deerinck et al40.
Protocol
Representative Results
Discussion
La complessità del sistema nervoso rappresenta una sfida significativa per ricostruire grandi volumi di tessuto e l'analisi della morfologia e distribuzione di organelli come mitocondri con adeguata risoluzione. Più celle tra neuroni, oligodendrociti e astrociti con numerosi processi estesi in tre dimensioni interagiscono all'interno del tessuto cerebrale 43. Poiché i mitocondri risiede sia nel soma di cellule e processi lontane, morfologia mitocondriale è estremamente pleomorfica nel sistema nerv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
| Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
| Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
| Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
| Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
| Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
| Tannic Acid | EMS | 21700 | |
| Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
| Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
| Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
| Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
| Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
| EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
| Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
| Ethanol | EMS | 15055 | |
| Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
| Embedding Mold | EMS | 70907 | |
| Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
| Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
| Razor | EMS | 72000 | |
| Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
| Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
| In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
| Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
| Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
| ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
| http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
| http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
| http://fiji.sc/TrakEM2 | |||
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