مراقبة قسم الميتوزى وديناميكية في الأجنة الزرد لايف
Summary
Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.
Abstract
الانقسام أمر بالغ الأهمية للنمو العضوي والتمايز. عملية ديناميكية للغاية ويتطلب أمرت الأحداث لتحقيق التكثيف السليم لونين، التعلق أنيبيب الحيز الحركي، العزل الصبغي، والانقسام السيتوبلازمي في فترة زمنية صغيرة. أخطاء في عملية حساسة يمكن أن يؤدي إلى الأمراض التي تصيب البشر، بما في ذلك العيوب الخلقية والسرطان. الأساليب التقليدية التحقيق الحالات المرضية الإنقسامية الإنسان غالبا ما تعتمد على أنظمة زراعة الخلايا، التي تفتقر إلى علم وظائف الأعضاء الطبيعي والتنموي / السياق الأنسجة محددة المفيد عند دراسة الأمراض التي تصيب البشر. هذا البروتوكول يتغلب على العديد من العقبات من خلال توفير وسيلة لتصور، مع ارتفاع القرار، وديناميات كروموسوم في النظام الفقاريات، الزرد. هذا البروتوكول سوف بالتفصيل النهج التي يمكن استخدامها للحصول على صور ديناميكية تقسيم الخلايا، والتي تشمل: النسخ في المختبر، وتربية الزرد / جمع ودمج الجنين، والوقت الفاصل بين التصوير. تحسين وmodifيتم استكشاف أيضا ications من هذا البروتوكول. باستخدام H2A.F / Z-EGFP (تسميات لونين) وmCherry-CAAX (تسميات غشاء الخلية) الأجنة حقن الرنا المرسال، الانقسام في AB-النوع البري، auroraB hi1045، وhi2865 esco2 هو تصور الزرد متحولة. عالية الدقة التصوير الحي في الزرد يسمح احد لمراقبة mitoses متعددة لقياس إحصائيا العيوب الإنقسامية وتوقيت تطور الإنقسامية. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ مراقبة الجوانب النوعية التي تحدد العمليات غير لائقة الإنقسامية (أي عيوب congression، missegregation من الكروموسومات، الخ) ونتائج الكروموسومات غير لائق (أي عدم توازن الصبغيات، تعدد الصيغ الصبغية، النويات، وما إلى ذلك). هذا الاختبار يمكن تطبيقها على مراقبة الأنسجة التمايز / التنمية وغير قابلة للاستخدام الزرد متحولة وكلاء الدوائية. تصور كيف عيوب في الانقسام تؤدي إلى السرطان والتنموية اضطرابات سوف كثيراتعزيز التفاهم من التسبب في المرض.
Introduction
الانقسام هو الحاسم الخلوي ضروري عملية النمو، والتمايز، وتجديد في الكائن الحي. على إعداد دقيق وتكرار الحمض النووي في الطور البيني، وكانت سببا في الخلية للقسمة. وبدأت المرحلة الأولى من الانقسام، الطور، من خلال تفعيل السيكلين B / Cdk1. يتميز الطور الأول من التكثيف من مادة الكروماتين في الكروموسومات. يحدث المغلف انهيار النووي في الانتقال بين الطور الأول وطليعة الطور التالي. في طليعة الطور التالي، جسيم مركزي، ومركز نواة للتشكيل المغزل، والبدء في الهجرة إلى أقطاب المعاكس في حين تمتد الأنابيب الدقيقة بحثا عن التعلق الحيز الحركي. عند الإلحاق، والتحويلات لوضع حد على التعلق أنيبيب وقوات التوتر توجيه الكروموسومات تشكيل لوحة الطورية 1. إذا تعلق جميع الكروموسومات بشكل صحيح، اقتنعت حاجز الجمعية المغزل، والمشقوق حلقات cohesin عقد الصبغي شقيقة معا، والأنابيب الدقيقة تقصير لسحب الشقيقةالصبغي إلى أقطاب المعاكس خلال طور الصعود 2،3. المرحلة النهائية، الطور النهائي، ينطوي على استطالة الخلية وإعادة تشكيل الغلاف النووي حول اثنين من نواة جديدة. السيتوبلازمي يكمل عملية الانقسام من خلال فصل السيتوبلازم اثنين من الخلايا الوليدة الجديدة 4-6. تغيير مسارات رئيسية الإنقسامية (أي حاجز الجمعية المغزل، ازدواجية الجسيم المركزي، chromatid الشقيقة التماسك، الخ.) يمكن أن يؤدي إلى اعتقال الطورية، missegregation من الكروموسومات، وعدم الاستقرار الجيني 7-10. في نهاية المطاف، ويمكن عيوب في مسارات السيطرة على الانقسام يسبب اضطرابات النمو والسرطان، مما استلزم تصور الانقسام وعيوبه في العيش، والفقاريات، كائن متعدد الخلايا 10-16.
الأجنة الزرد بمثابة كائن نموذج رائع للتصوير الحية ويرجع ذلك إلى نسيج شفاف، وسهولة حقن مكروي، والتطور السريع. باستخدام الزرد، والهدف العام من هذا المخطوط هووصف وسيلة 5D الحية (أبعاد X، Y، Z، والوقت، والطول الموجي) التصوير من الانقسام 17 (الشكل 1C). استخدام الزرد متحولة خلل في مسارات مختلفة الإنقسامية تدليل على ذلك من مثل هذه العيوب. لهذا البروتوكول، وقد تم اختيار أورورا باء وEsco2 المسوخ لتوضيح هذه العيوب. أورورا B هو كيناز الذي هو جزء من مجمع كروموسوم الركاب (CPC) تشارك في تشكيل المغزل والتعلق أنيبيب. مطلوب أيضا لتشكيل انشقاق ثلم في السيتوبلازمي 18،19. في الزرد، ونقص أورورا B يؤدي إلى عيوب في الحث ثلم، السيتوبلازمي، وكروموسوم الفصل 20. Esco2، من ناحية أخرى، هو أسيتيل التي لا غنى عنها لchromatid الشقيقة التماسك 21،22. ومن acetylates cohesin على الجزء SMC3 من الحلبة وبالتالي استقرار cohesin لضمان الفصل كروموسوم السليم في المرحلة الانتقالية الطورية طور الصعود 23. فقدان Esco2 في الزرد يؤدي إلى التشابترmissegregation romosome، من السابق لأوانه الفصل الكروماتيدات الشقيقة، عدم الاستقرار الجيني، والتي تعتمد على البروتين p53 وموت الخلايا المبرمج مستقلة 24،25. ونظرا لتوفر، auroraB hi1045، وhi2865 esco2 الزرد متحولة (يشار إليها فيما aurB م / م وesco2 م / م، على التوالي) وسوف تستخدم لتوضيح هذه التقنية 25-27.
وقد مكن اقتران متحد البؤر المجهري مع الآلات خلية فلوري الموسومة الباحثين إلى تصور لونين وغشاء الخلية ديناميات خلال الانقسام 25،28،29. تاريخيا استخدمت الهستونات الفلورسنت الموسومة إلى تصور لونين. الهستونات هي البروتينات النووية مكونة من أربعة أزواج مختلفة (H2A، H2B، H3، H4 و) التي هي المسؤولة عن هيكل جسيم نووي أن يؤلف الكروموسومات 30. في حين H2B يمكن القول إن هيستون الأكثر استخداما لالبروتينات الفلورية فيوقد ثبت الماوس وزراعة الخلايا، واستخدام هيستون 2A، Z الأسرة (H2A.F / Z) تماما للاستخدام في الزرد 31،32. كونكانافالين ألف والكازين كيناز 1-جاما على سبيل المثال، تعريب لغشاء الخلية، وقد أظهرت سابقا فعالا في تصور غشاء الخلية في قنافذ البحر وذبابة الفاكهة 33،34. وقد أظهرت دراسات أخرى أن CAAX بروتين فلوري الموسومة تسميات غشاء الخلية وكان ناجحا في الزرد 31. CAAX هو الحافز معترف بها من قبل الأنزيمات المعدلة بعد متعدية مثل farnesyltransferases وgeranylgeranyltransferases. تعديلات من قبل هذه الانزيمات تسبب البروتينات التي تساعدهن على غشاء المرتبطة بها، وبالتالي وصفها غشاء الخلية 35.
بسبب الاستخدام السابق في الزرد، واختار هذا البروتوكول لاستخدام H2A.F / Z وCAAX لتسمية لونين وغشاء الخلية. وتطبيق هذه الطريقة تسمح للباحث لمراقبة الانقسام على مستوى الخلية الفردية لمراقبة كروموسوم فرديديناميكية، وكذلك في وقت واحد يراقب الانقسامات الخلوية المتعددة التي قد تؤثر على تمايز الأنسجة والتنمية. هذه المادة سوف تركز على تصوير ديناميات فصل الكروموسومات خلال الانقسام على مستوى الخلية الفردية. ضمن هذه المخطوطة، والقدرة على مراقبة عدة أقسام الإنقسامية، حساب الوقت الانقسام، وفك الظواهر الإنقسامية سيتم توضيح ومناقشتها. باستخدام هذه المعايير، من الناحية الفسيولوجية البيانات ذات الصلة يمكن جمعها وتطبيقها على عدة ولايات المرض تتأثر العيوب الإنقسامية.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام هذا الأسلوب يسمح احد لاستنتاج انهيار النووي المغلف، وتشكيل لوحة الطورية بواسطة إرفاق ملفات-أنيبيب الحيز الحركي، والفصل بين الصبغي الشقيقة لتشكيل لجنتين خلايا جديدة في الجسم الحي وبطريقة تعتمد على الوقت. القدرة على مراقبة الانقسام في الزرد هو مفيد على ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).
Materials
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
Riferimenti
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943 (2015).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd, ., J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O’Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
