ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します
Summary
Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.
Abstract
有糸分裂は、生物の増殖および分化に重要です。プロセスは非常に動的であり、短い時間枠内で適切なクロマチン凝縮、微小管動原体結合、染色体分離、および細胞質分裂を達成するために、イベントを命じする必要があります。繊細なプロセスのエラーは、出生異常や癌を含む、ヒトの疾患につながることができます。ヒトの有糸分裂の疾患状態を調査する従来のアプローチは、多くの場合、ヒトの疾患を研究する自然な生理機能および有利な発達/組織特異的な文脈を欠いている細胞培養系に依存しています。このプロトコルは、高解像度、脊椎動物のシステムにおける染色体ダイナミクス、ゼブラフィッシュで、視覚化する方法を提供することで、多くの障害を克服します。このプロトコルの詳細が含ま分裂細胞の動的な画像得るために使用することができるのアプローチは以下となります。in vitro転写、ゼブラフィッシュの繁殖/収集、胚の埋め込 み、およびタイムラプスイメージングを。最適化とMODIFこのプロトコルのicationsも模索されています。 H2A.F / Z-EGFP（ラベルのクロマチン）を使用し、mCherryを-CAAX（ラベルの細胞膜）のmRNAを注入した胚、AB野生型で有糸分裂、 オーロラの hi1045、およびesco2の hi2865変異体ゼブラフィッシュが可視化されます。ゼブラフィッシュにおける高解像度のライブイメージングは1つが統計的に有糸分裂欠陥や有糸分裂進行のタイミングを定量化するために、複数の有糸分裂を観察することができます。また、不適切な（ すなわち、会合欠損、染色体のmissegregation、 等 ）有糸分裂プロセス及び不適切な染色体結果（ すなわち、異数性、倍数性、小核、 等）を定義質的側面 の観察が観察されます。このアッセイは、組織分化/開発の観測に適用され、変異体ゼブラフィッシュ及び薬理学的薬剤の使用に適していることができます。有糸分裂の欠陥が癌や発達障害になります大幅につながる方法の可視化疾患の病因の理解を高めます。
Introduction
有糸分裂は、生体内の増殖、分化、および再生のための重要な細胞プロセスに不可欠です。正確な準備と間期におけるDNAの複製の際に、細胞は分裂するプライミングされます。有糸分裂の第一期、前期は、サイクリンB / Cdk1のの活性化によって開始されます。前期は、染色体にクロマチン材料の凝縮によって特徴付けられます。核膜の内訳は、前期と中期の間の遷移で発生します。前中期では、中心体は、紡錘体形成のための核形成中心は、動原体の添付ファイルの検索で微小管を拡張しながら反対の極に移行し始めます。取り付け時には、変換は微小管の添付ファイルを-終了すると張力は、中期板1を形成する染色体を向けます。すべての染色体が正しく接続されている場合、スピンドルアセンブリチェックポイントが満たされ、一緒に姉妹染色を保持コヒーシン環が切断され、および微小管は妹を引っ張って短くされています後期2,3の間に反対の極にクロマチド。最終段階、終期は、二つの新しい核の周りに核膜のセルと改革の伸長を伴います。細胞質分裂は、2つの新しい娘細胞4-6の細胞質を分離することにより、分割プロセスを完了します。キー有糸分裂経路（ すなわち、紡錘体形成チェックポイント、中心体の複製、姉妹染色分体の接着など ）の変更は、中期停止、染色体のmissegregation、およびゲノム不安定性7-10をもたらすことができます。最終的には、有糸分裂を制御する経路における欠陥は、有糸分裂およびライブでの欠陥、脊椎動物、多細胞生物10-16の可視化を必要と、発達障害やがんを引き起こす可能性があります。
ゼブラフィッシュの胚は透明な組織、マイクロインジェクションの容易さ、および迅速な開発によるライブイメージングのための偉大なモデル生物としての役割を果たす。ゼブラフィッシュを用いて、この原稿の全体的な目標はにありますライブ5D有糸分裂17（ 図1C）の（寸法X、Y、Z、時間、及び波長）イメージングの方法を記載します。別の有糸分裂経路における欠損変異体ゼブラフィッシュの使用は、このような欠陥の結果を示しています。このプロトコルについては、オーロラBおよびEsco2変異体は、これらの欠陥を説明するために選択しました。オーロラBは、紡錘体形成と微小管の添付ファイルに関わる染色体パッセンジャー複合体（CPC）の一部であるキナーゼです。また、細胞質分裂18,19内の分裂溝の形成のために必要とされます。ゼブラフィッシュでは、オーロラBの欠乏は畝間誘導、細胞質分裂、および染色体分離20の欠陥につながります。 Esco2は、他の一方で、姉妹染色分体凝集21,22のために不可欠であるアセチルトランスフェラーゼです。したがって、中期、後期の遷移23で適切な染色体分離を確保するために、コヒーシンの安定化リングのSMC3部にコヒーシンをアセチル化。ゼブラフィッシュにおけるEsco2の損失をCHにつながりますromosome missegregation、早期の姉妹染色分体の分離、ゲノム不安定性、およびp53依存性および非依存性アポトーシス24,25。在庫状況により、 オーロラの hi1045、およびhi2865変異ゼブラフィッシュをesco2に（以下、それぞれ、aurB メートル/メートルと呼ばれ、esco2 m / m）のこの手法25-27を説明するために使用されます。
蛍光タグ付き細胞機構とのカップリング共焦点顕微鏡は、有糸分裂25,28,29の間にクロマチンと細胞膜動態を可視化する研究を可能にしました。蛍光タグ化ヒストンは、歴史的にクロマチンを可視化するために使用されてきました。ヒストンは、染色体30を構成するヌクレオソーム構造を担当している4異なる対（H2A、H2B、H3、およびH4）からなる核タンパク質です。 H2Bは間違いなく中の蛍光タンパク質のための最も使用されるヒストンですがマウスおよび細胞培養、ヒストン2Aの使用、家族Z（H2A.F / Z）はゼブラフィッシュ31,32で使用するために十分であることが判明しました。コンカナバリンA及びカゼインキナーゼ、例えば、1-γは、細胞膜に局在し、以前にウニとショウジョウバエ33,34に細胞膜を可視化するのに有効なことが示されています。他の研究では、CAAX蛍光標識タンパク質が細胞膜を標識することが示されており、ゼブラフィッシュ31に成功したしました。 CAAXは、farnesyltransferasesやgeranylgeranyltransferasesなどの翻訳後修飾酵素によって認識されるモチーフです。これらの酵素による修飾は、タンパク質は、このように細胞膜35を標識する 、膜結合になることが。
ゼブラフィッシュでの使用前に、このプロトコルは、クロマチンと細胞膜を標識するためにH2A.F / ZとCAAXを使用することにしました。この方法の適用は、個々の染色体を観察するために、研究者は、個々の細胞レベルで有糸分裂を監視することができますダイナミクスは、だけでなく、同時に組織分化と発達に影響を与える可能性のある複数の細胞分裂を監視します。この記事では、個々の細胞レベルでの有糸分裂の際に染色体の分離のダイナミクスを画像化に焦点を当てます。この原稿の中に、いくつかの有糸分裂を観察する分割時間を計算し、有糸分裂の表現型を解読する能力が示され、説明されます。これらのパラメータを用いて、生理学的に関連するデータを収集することができ、有糸分裂の欠陥の影響を受け、いくつかの疾患状態に適用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法を使用すると、1が生体内および時間依存的に二つの新しい細胞を形成するために核エンベロープの崩壊、微小管動原体の添付ファイルによって中期板の形成、及び姉妹染色分の分離を推測することができます。細胞は天然の生理学で撮像されているので、ゼブラフィッシュで有糸分裂を観察する能力は、固定サンプル、細胞培養系に比べて有利であり、組織は、使用する蛍光…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).
Materials
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
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