Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza<em> In Situ</em> Ibridazione (FISH) con sonde PNA in<em> Caenorhabditis elegans</em

Summary

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Abstract

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)¹. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT². Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Introduction

Telomeri protegge le estremità cromosomiche dalla fusione aberranti e degrado. telomeri mammiferi è composta da G-ricchi ripete esamerica, TTAGGG, e complessi shelterin. La sequenza di ripetizione telomerica del nematode è simile a quelle dei mammiferi (TTAGGC). La maggior parte degli eucarioti utilizzano telomerasi per aggiungere le ripetizioni dei telomeri alle loro estremità cromosomiche. Tuttavia, il 10 – 15% delle cellule tumorali utilizzano telomerasi meccanismo indipendente, conosciuto come allungamento dei telomeri alternativo (ALT) ^3. In precedenza, abbiamo riportato che ripete telomeri e le sue sequenze associate, come il nome TALT, sono stati amplificati nei telomeri di linee mutanti telomerasi che sono sopravvissuti la sterilità critica ^2.

La lunghezza dei telomeri è stata misurata mediante PCR quantitativa o Southern blot, che fornisce la lunghezza media dei telomeri totale ^4,5,6,7. Leggi conteggio di ripetizione dei telomeri in tutto il sequenziamento del genoma dei dati è anche un indicatore del totale contenuti telomeri ^8. Sebbene SinGLE Telomere Lunghezza Analysis (STELA) potrebbe fornire la lunghezza di un singolo telomero, essa non può fornire informazioni spaziali dei telomeri ^9. Mentre POT-1 :: mCherry proteina reporter fornisce le informazioni spaziali dei telomeri in vivo, non può rappresentare lunghezze dei telomeri a doppio filamento, come POT-1 è un telomero singolo filamento proteico il ¹⁰ vincolante.

Mentre i metodi di cui sopra prevedono l'informazione media delle sequenze ripetitive, ibridazione in situ fluorescente (FISH) permette di osservare la quantità e la distribuzione spaziale delle singole sequenze di interesse su scala cromosomica. Invece di purificazione del DNA, tessuti o cellule vengono fissate per mantenere le informazioni nativo spaziale FISH. Così, il pesce è uno strumento sia quantitativa e qualitativa per l'osservazione delle singole sequenze ripetute, come ripete telomeri.

Questo protocollo fornisce un metodo efficiente per la rilevazione simultanea di entrambi telomeri e altre repliche basate su miglioramenti da metodi descritti in precedenza ^11,12. C. elegans larve o adulti sono organismo multicellulare con cellule altamente differenziate. L'eterogeneità delle cellule impedisce sull'analisi quantitativa di un gran numero di macchie telomeri. Per massimizzare il numero di cellule analizzate, gli embrioni sono isolati e diffondere sugli scivoli polilisina rivestita per i pesci. Inoltre, questo protocollo può anche essere combinato con immunofluorescenza.

Come prova che il protocollo funziona, mostriamo che è possibile osservare e quantificare due differenti sequenze ripetitive. sonda di DNA contro TALT1 è stata generata con semplice PCR che incorpora digossigenina-dUTP. Poi questa sonda TALT1 e sonda PNA telomeri fluorescenza marcati sono stati ibridati simultaneamente. Successivamente, digossigenina stato rilevato con metodi di immunofluorescenza canonici. Vi presentiamo qui le immagini rappresentative dove TALT1 colocalizzava con il telomero in TRT-1 </eM> i sopravvissuti.

Protocol

1. Sonde Etichettatura con digossigenina-dUTP mediante PCR Eseguire etichettatura PCR con 10x dNTP mix contenente digossigenina-dUTP come descritto in precedenza 13. Purificare prodotto di PCR con la purificazione spin-colonna secondo le istruzioni del produttore. Se la sonda è più breve di 200 bp, rimuovere libera digossigenina-dUTP con cromatografia spin-colonna dalla miscela di reazione piuttosto che depurazione spin-colonna. 2. Pre…

Representative Results

In precedenza era stato riferito che sopravvissuto ALT può emergere dal mutante telomerasi-deficienti, TRT-1 (ok410), in bassa frequenza replicando localizzato internamente 'Modello di ALT' (TALT) sequenze per telomeri manutenzione 2. Utilizzando la sonda PNA, siamo stati in grado di visualizzare telomeri nelle gonadi sezionati (Figura 2A). Il segnale telomeri debole è stato rilevato sia in TRT-1 (ok410) e ALT superstite. Il segnale…

Discussion

Il vantaggio principale del nostro protocollo è la semplicità della procedura senza danni evidenti alla morfologia della struttura cellulare. Diversi passaggi sono stati ottimizzati per C. elegans FISH in questo protocollo. I passaggi critici per i pesci di successo includono l'etichettatura di sonde, la fissazione di embrioni e la penetrazione. metodo di etichettatura digossigenina-dUTP fornisce un metodo di etichettatura di facile utilizzo mediante PCR o nick-translation. Per etichettare lunga sequenza …

Materials

PNA probe	PANAGENE	custom order
Anti-Digoxigenin-Fluorescein, Fab fragments	Roche	11207741910	use 1:200 diluted in PBST
Digoxigenin-dUTP	Roche	11573152910
Bovine serum albumin	SIGMA-ALDRICH	A-7906
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	P-6148	prepare 4% paraformaldehyde by heating in DW with few drops of NaOH. add 0.1 volume of 10x PBS.
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
Hybridizaiton solution			3X SSC, 50% formamide, 10% (w/v) dextran sulfate, 50 ug/ml heparin, 100 ug/ml yeast tRNA , 100ug/ml sonicated salmon sperm DNA
Hybridizaiton wash solution			2X SSC, 50% formamide
Formamide	BIONEER	C-9012	toxic
Methanol	Carlo Erba
Acetone	Carlo Erba
Heparin	SIGMA-ALDRICH	H3393	make 10 mg/ml for stock solution
Dextran sulfate	SIGMA-ALDRICH	67578
10X PBS			For 1 Liter DW : 80 g NaCl, 2.0 g KCl, 27 g Na2HPO4:7H2O, 2.4 g KH2PO
PBST			1X PBS, 0.1% tween-20
Polysorbate 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	Commercial name is Tween-20
Poly-L-Lysine solution (0.1 % w/v)	SIGMA-ALDRICH	P-8920	prepare fresh 0.01 % w/v solution before use
M9			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 L
Bleaching solution			20% sodium hypochlorite, 0.5 M KOH
Antibody buffer			1X PBST, 1mM EDTA, 0.1% BSA, 0.05% Sodium azide (toxic)
Blocking solution			Antibody buffer with 5% bovine serum albumin (BSA)
illustra Microspin G-50	GE healthcare	27-53310-01
20X SSC			To make 1L, 175.3 g of NaCl, 88.2 g of sodium citrate, H2O to 1 L, adjust pH to 7.0
2X SSCT			2X SSC, 0.1 % tween-20
10x digoxigenin-dUTP mix			1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65mM dTTP, 0.35mM DIG-11-dUTP
PCR purification columns	Cosmo genetech	CMR0112
Glass cleaner / ULTRA CLEAN	Dukssan pure chemicals	8AV721
Multi-well glass slide	MP biomedicals	96041205
Nematode growth media			to make 1 L, 3 g of NaCl, 17 g of agar, 2.5 g of peptone, H2O to 974 mL. Autoclave and cool the flask. Add 1 mL of 1M CaCl2, 1 ml of 4 mg/mL cholesterol in ethanol, 1 ml of 1 M MgSO4, 25 mL of 1 M KPO4.
Levamisole	SIGMA-ALDRICH	196142
Razor	Feather	blade No. 11
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
Equipments
Confocal microsope	Zeiss	LSM 510	EC Plan-Neofluar 100x was used as objective lens.
Dry block / aluminum block	Labtech	LBH-T03	Set temperature to 80℃
Humid chamber			Plastic box filled with paper towel soaked in DW
Image Analysis Software	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502