This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.
Extrachromosomale zirkuläre DNAs (eccDNAs) sind gemeinsame genetische Elemente in Saccharomyces cerevisiae und in anderen Eukaryoten als auch berichtet. EccDNAs beitragen unter somatischen Zellen in mehrzelligen Organismen zu genetischen Variation und Entwicklung von einzelligen Eukaryoten. Sensitive Methoden für eccDNA Nachweis nötig sind, um zu klären, wie diese Elemente Genomstabilität beeinflussen und wie ökologische und biologische Faktoren, die ihre Ausbildung in eukaryotischen Zellen zu induzieren. Dieses Video stellt eine empfindliche eccDNA-Reinigungsverfahren genannt Kreis-Seq. Das Verfahren umfasst eine Säulenreinigung von zirkuläre DNA, die Entfernung der verbleibenden linearen chromosomalen DNA, Rolling-Circle-Amplifikation von eccDNA, tiefe Sequenzierung und Kartierung. Umfangreiche Exonucleasebehandlung wurde für eine ausreichende lineare chromosomale DNA-Abbau erforderlich. Der Rollkreis Amplifikationsschritt durchine-height:. normal; "> φ 29 – Polymerase für zirkuläre DNA über lineare DNA angereichert Validierung des Kreis-Seq – Methode auf drei S. cerevisiae CEN.PK Populationen von 10 10 Zellen nachgewiesen Hunderte von eccDNA Profile in Größen , die größer als 1 Kilobasen- . Wiederholte Funde von ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 Gene auf zirkuläre DNA in beiden S288c und CEN.PK legt nahe , dass DNA circularization zwischen den Stämmen an diesen Loci. in der Summe der Circle-Seq – Methode verfügt über eine breite konserviert Anwendbarkeit für genomweite Screening für eccDNA in Eukaryonten sowie für bestimmte eccDNA Typen zu erfassen.
früh oder transiente chromosomale Amplifikation Erkennen ist schwierig, weil es Veränderungen in einzelnen DNA-Identifizierung von Molekülen, in großen Populationen von Zellen erfordert. Chromosomale copy-number Variationen (CNVs) sind im Allgemeinen gut nach ihrer Einrichtung erkannt, nur die endgültige CNV Struktur als Beweis für den Mechanismus zu verlassen, die die Variation 1,2 erzeugt. Das Erkennen und extrachromosomale zirkuläre DNA (eccDNA) in früheren Stadien der CNV Bildung erholt könnte laufenden Prozesse in der genomischen Umlagerungen aufzuklären.
Zuvor de novo Entdeckung eccDNA wurde durch elektronenmikroskopische Aufnahmen 3, Giemsa – Färbung von Chromosomen in der Metaphase 4 oder zweidimensionalen Gelelektrophorese 5. Diese Methoden bieten wenig oder keine Information über die Sequenz der zirkulären DNA. Gezielte Techniken wie Southern Blotting 6,7, inverse PCR 8 oder Fluoreszenz – di – situ hybridization 9 belegen nur über bestimmte eccDNA Elemente. Keines dieser Verfahren liefern die Abfolge aller vorhandenen eccDNA Typen in einer Zellpopulation.
Genomische Divergenz in einem Pool von Zellen kann durch Genom – Sequenzierung und / oder Tiling Arrays 10,11 charakterisiert werden. Eine Deletion oder Verstärkung durch herkömmliche DNA – Reinigungsverfahren Nachweis erfordert in der Regel , dass ein mutiertes Allel mindestens 0,1-1% der Zellpopulation repräsentieren 12,13. Azentrische eccDNAs erwartet noch mehr transient in einer Zellkultur zu sein, wegen ihres Mangels an Romeren und potentielle Abwesenheit der DNA-Synthese bei der Replikation. Da somit vermutlich die meisten eccDNAs in geringen Mengen sind und deren Sequenzen ähneln dem Genom werden alternative DNA-Extraktionsverfahren benötigt eccDNAs zu erkennen.
Mehrere zirkuläre DNA-Reinigungstechniken nutzen die strukturellen Unterschiede zwischen den Chromosomen und zirkuläre DNA. Beispielsweise Hochgeschwindigkeits ultracentrifugation in Cäsiumchlorid – Gradienten verwendet 350-3000 Basenpaare (bp) große eccDNAs aus dem menschlichen HeLa – Krebszelllinie 14 zu isolieren. Allerdings kann mit hoher Geschwindigkeit brechen oder nick das Rückgrat der supercoiled zirkuläre DNA – Strukturen, die Änderung der Sedimentationsgeschwindigkeit 15 und die eccDNA Ausbeute. Dutta und Mitarbeiter entwickelten ein Verfahren zur de novo, genomweite Identifikation von zirkulären DNA aus Mausgeweben sowie aus Kulturen von Hühner- und menschlichen Zellen 16,17. Ihre Methode ist die Extraktion von Keimen aus homogenisierten Gewebe durch Saccharose-Ultrazentrifugation, gefolgt von Plasmidaufreinigung und mehrere Runden von enzymatischen Reaktionen und DNA-Extraktionen. Ihr Protokoll identifiziert in erster Linie 200-400 bp eccDNAs, genannt microDNAs. Dutta und Mitarbeiter auch Reinigung von microDNAs aus Saccharomyces cerevisiae versucht , aber konnte nicht microDNA aus dieser Hefearten 16 aufzunehmen.
Wir haben ein neues Verfahren entwickelt fürde novo Nachweis von eccDNA aus Hefe genannt Kreis-Seq. Dieses Verfahren ermöglicht die genomweite Erhebungen für zirkuläre DNA-Moleküle groß genug ganze Gene und so groß wie das 86 Kilobasen (kb) mitochondriale DNA (mtDNA) zu tragen. Der Kreis-Seq – Methode wurde aus einem gut etablierten prokaryontischen Plasmid Reinigungsverfahren 18,19, optimiert für eukaryotische Hefezellen und kombiniert mit tiefen Sequenzierung entwickelt. Mit dem Kreis-Seq Ansatz 1756 verschiedene eccDNAs, die alle größer als 1 kb wurden aus zehn S. entdeckt cerevisiae S288c Populationen 20. Eine Größe cut-off wurde auf eccDNA konzentrieren ausgewählt, die ganze Gene tragen groß genug waren. Kreis-Seq war sehr empfindlich; detektiert einen einzigen eccDNA innerhalb Tausende von Zellen 20. In der aktuellen Studie wurde Kreis-Seq zu isolieren und zu identifizieren 294 eccDNAs von drei biologischen Replikate von anderen S. verwendet cerevisiae Hefestamm, CEN.PK. Die Daten zeigen, dass eccDNA eine gemeinsame genetische eleme istnt in S. cerevisiae – Stämme.
Der Kreis-Seq-Methode ermöglicht es genomweite Detektion von eccDNA aus Hefezellen mit Sequenz-Level-Auflösung. Das Verfahren ist eine milde Reinigung eccDNA die nicht intensive Wirbel oder Pipettieren erfordert und verwendet Säulentrennung durch Schwerkraft eccDNA Bruch zu begrenzen, die Exonuclease-Verdau im nachfolgenden Schritt führen würde. Diese Merkmale des Verfahrens kann zur Detektion großer eccDNAs entscheidend sein, die Gensequenzen enthalten. Kreis-Seq zahlreiche eccDNAs einschließlich der vollständigen Gene (Datensatz 1) nachgewiesen. Es erfasst auch die 86-kb Hefe-Mitochondrien-DNA. Somit erleichtert dieses Protokoll Reinigung von großen runden DNA-Elemente. Halten der Anzahl von DNA-Extraktionsschritte auf ein Minimum reduziert das Risiko von eccDNA Verlust und maximiert die Ausbeute. Basierend auf den Ergebnissen für die Steuerung, gespickt-in Plasmiden, Kreis-Seq sehr empfindlich ist, eine einzige kreisförmige DNA aus 2500 Zellen zu erkennen. Weiterhin Entfernen reichlich endogene Plasmide wie 2μ; Plasmid oder Mitochondrien-DNA könnte signifikant Empfindlichkeit erhöhen. Die Aushärtung von 2μ aus Hefekulturen wurde 30 beschrieben. Alternativ könnte 2μ und mitochondriale DNA Entfernung mit einer seltenen Schneid Endonuklease erreicht werden, wie beispielsweise SwaI. Allerdings könnte das Restriktionsenzym Schritt andere eccDNAs von Interesse zielen und die Gesamt eccDNA Ausbeute begrenzen.
Kritische Schritte zur Erkennung eccDNA waren Entfernung von linearer DNA (Schritt 3) und DNA-Sequenzierung (Schritt 5) zu einer geeigneten Tiefe. Um die Mehrheit der eccDNAs aus einer Zellpopulation, tiefe Sequenzierung erfassen könnte 20 erforderlich. Gepaart-End-Sequenzierung sollte noch mehr Vertrauen der eccDNA Nachweis liefern, als zirkuläre DNA-Kreuzungen werden erwartet, gepaart-End zu erhalten liest discordantly diese Karte. Diese Diskrepanzen unterstützen die Entdeckung von kreisförmigen DNA-Strukturen und kann möglicherweise als zusätzliche eccDNA Detektionsfilter verwendet werden.
Der Kreis-Seq Verfahren wurde unter Verwendung von drei unabhängigen S. validiert cerevisiae CEN.PK Populationen. Erkannt Sequenzen enthalten zuvor eccDNAs, endogene Plasmide berichtet und versetzt in Plasmide und Hunderte von mutmaßlichen eccDNAs (Datensatz 1). Diese Ergebnisse stützen frühere Kreis-Seq Datensätze von S. cerevisiae S288c 20. Die Entdeckung von mehreren eccDNAs gemeinsam CEN.PK und S288c Populationen zeigt , dass diese Loci haben eine Neigung als kreisförmige Elemente vorhanden sind (Figur 4). Wir haben früher , dass die [Kreis LÜCKE1] gezeigt 8 unter Stickstoff begrenzten Bedingungen im CEN.PK Hintergrund angereichert ist, obwohl Beweise für [LÜCKE1 Kreis] in anderen Stamm Hintergründe nicht gefunden wurde. Auffindung des eccDNA aus dem CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 und HXT6 HXT7 Loci in beide S288c und CEN.PK legt nahe , dass eine Veranlagung für die DNA – circularization ist conzwischen den Hefestämmen angeboten. Es bleibt zu zeigen , wenn [HXT6 / 7 Kreis], [ASP3-1 Kreis], [COS111 Kreis] und [CUP1-1 RSC30 Kreis] selektive Vorteile Zellen verleihen oder wenn ihre Existenz ist nur ein Effekt der hohen Raten von DNA circularization.
Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass Kreis-Seq zum Erfassen Kilobasen–sized eccDNAs gut geeignet ist, und hat Vorteile für eccDNAs mit vollständigen Genen identifiziert. Kreis-Seq ist ein hochempfindliches Verfahren, das gesamte Genom-Skala Bildschirme von eccDNAs aus Hefe ermöglicht. Der Kreis-Seq Methode könnte ein neues Feld der Forschung an der Aufklärung der Rolle von eccDNA Ziel öffnen in der Gen-Deletionen und Amplifikationen erzeugen. Da die DNA-Architektur und Struktur von eukaryotischen Hefe zu höheren Eukaryonten weitgehend erhalten, die Kreis-Seq-Methode sollte im Prinzip sein applicable zu allen eukaryotischen Zellen, mit leichten Modifikationen. Derzeit ist das Verfahren nicht erscheinen keine Grenzen zu haben, obwohl seine Fähigkeit Megabasen große eccDNAs zu reinigen hat noch gezeigt werden. Darüber hinaus ist die Verwendung von DNA – Polymerase O29, die eine rolling-circle – Verstärkungsverfahren 31 verwendet, erzeugt eine Tendenz zu kleineren eccDNAs Herstellung eccDNA Quantifizierung erschwert. Kreis-Seq erkennt eccDNAs groß genug vollständige Gene zu tragen, so dass es für Studien über Doppel Minuten-zirkuläre DNA aus menschlichen Körperzellen zu machen. Doppel Minuten kann zu Krebs beitragen , wenn Proto-Onkogene auf diesen Elementen 32-37 verstärkt werden. Studien von eccDNAs in konnte Keimbahnzellen verwendet werden, Keimbahnmutation Raten zu messen und die Spermienqualität, zum Beispiel in der Tier beurteilen. Somit hat Kreis-Seq das Potential Einblicke in die Rate zu erhalten, bei der genetischen Variation in der Form Variation der Kopienzahl entsteht, und auf ein neues Verständnis von Krankheiten führen, die Gen kopier beinhaltenZahlvariation 38-40.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Kenn D. Møller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. Jørgensen for quantitative PCR analysis.
Bacto peptone | BD Difco | 211677 | Alternative product can be used. |
Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix | Agilent Technologies | 600882 | For qPCR analysis. Alternative product can be used. |
Dextrose (D-glucose) | Carl Roth | HN06.4 | Alternative product can be used. |
Disruptor Beads, 0.5 mm | Scientific Industries, Inc. | SI-BG05 | Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used. |
Ethidium bromide | Carl Roth | 2218.2 | Agarose gel stain for detecting DNA/RNA. |
GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo Fisher | K0502 | Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used |
NotI, FastDigest | Life Technologies - Thermo Fisher Scientific, USA | FD0594 | Endonuclease. Alternative product can be used. |
Plasmid Mini AX kit | A&A Biotechnology, Poland | 010-50 | Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA. |
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit | Epicentre, USA | E3105K | ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used. |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich, USA | 81845 | Alternative product can be used. |
pUG6 plasmid | EUROSCARF, Germany | P30114 | Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch |
QIAGEN genomic-tip 100/G | Qiagen, USA | 13343 | Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used. |
REPLI-g Mini Kit protocol | Qiagen, USA | 150023 | Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase |
Yeast extract | BD Difco | 210929 | Alternative product can be used. |
Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) | Nordic BioSite, Sweden | Z1004-3 | Alternative product can be used. |
Data access to sequence files | European Nucleotide Archive | EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. | |
Strains | |||
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | Genotype MATa MAL2-8c SUC2 | ||
Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool | EUROSCARF, Germany | S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 genexxx::KanMX. | |
Equipments | |||
DNA Spectrophotometer | NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher | Measuring DNA concentration. Alternative product can be used. | |
Fluorescence microscopy | Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. | Alternative product can be used. | |
Robotic library-build system | Apollo 324, IntegenX Inc. | DNA library preparation. Alternative product can be used. | |
Sequencing platform | Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. | DNA sequencing. Alternative product can be used. | |
Ultrasonicator | Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes | Alternative product can be used. | |
Methods | |||
2% YPD media | Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave. | ||
Circle-Seq test on genomic DNA | Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. | ||
Mapping software | Bowtie2 aligner, John Hopkins University | Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359. | |
Propidium iodide stain | Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). | ||
Workflow bioinformatic system | Galaxy, Open source. | A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. "Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists". Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. "Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis." Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5. |