Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

Summary

lesioni renali sostenuti da nefrotossine, che comprendono farmaci che vanno dagli antibiotici ai chemioterapici, può portare a disturbi complessi, la cui patogenesi rimane completamente sconosciuto. Questo protocollo dimostra come zebrafish può essere utilizzato per la malattia modellazione di queste condizioni, che possono essere applicati alla individuazione di misure renoprotettivi.

Abstract

I reni sono suscettibili di nuocere dall'esposizione a sostanze chimiche che filtrano dal flusso sanguigno. Questo può portare a lesioni d'organo associata ad un rapido declino della funzione renale e lo sviluppo della sindrome clinica nota come danno renale acuto (AKI). agenti farmacologici usati per trattare le circostanze mediche che vanno da un'infezione batterica al cancro, quando somministrato singolarmente o in combinazione con altri farmaci, possono avviare AKI. Zebrafish sono un modello animale utile per studiare gli effetti chimici sulla funzione renale in vivo, in quanto costituiscono un rene embrionale composto di unità funzionali nefrone che sono conservati con vertebrati superiori, compreso l'uomo. Inoltre, zebrafish può essere utilizzata per eseguire schermi genetici e chimici, che offrono opportunità per chiarire gli aspetti cellulari e molecolari di AKI e sviluppare strategie terapeutiche, come l'identificazione di molecole nefroprotettivo. Qui, dimostriamo come microiniezione nelzebrafish può essere utilizzato come un paradigma per gli studi nefrotossina.

Introduction

Aki è una perdita improvvisa della funzione renale che può portare a conseguenze per la salute devastanti ^1. AKI è un problema sanitario rilevante in tutto il mondo a causa della sua elevata incidenza di circa il 20% tra i pazienti ospedalizzati, con tassi ancora più elevati di 30-50% nei casi di terapia intensiva e gli anziani, e il tasso di mortalità del 50-70% ^1-3. Purtroppo, la prevalenza di AKI è in aumento e si prevede a crescere ulteriormente nel prossimo decennio, in parte a causa della diversità dei fattori che possono indurre AKI, che includono stress post-operatorio, ischemia, e l'esposizione a nefrotossine come antibiotici e farmaci chemioterapici ^4.

AKI comporta danni cellulari improvvisa all'interno del rene, che si verificano comunemente in nefroni, che sono le unità funzionali essenziali, e sono composti da un filtro del sangue e un tubulo segmentato che drena l'urina in collettori centrali ^1. Quando un numero significativo di nefroni sonodanneggiato durante AKI, gli effetti immediati di una interruzione della clearance rifiuti dalla circolazione, e il flusso del fluido ridotta o abolita attraverso nefroni a causa di ostruzione da cellule morte e morenti ^1. Nel corso del tempo, l'ostruzione tubolare può portare alla degenerazione di intere nefroni, che riduce in modo permanente la funzione renale ^1. Alterazioni fisiologiche nel rene seguenti AKI coinvolgono anche eventi infiammatori complessi che possono portare a cicatrici cronica ^1.

Nonostante questi risultati, nefroni hanno una certa capacità di subire rigenerazione dopo AKI che ricostituisce il ^5,6 tubolare dell'epitelio. Mentre vi è stata una comprensione molecolare crescente di rigenerazione nefrone, i meccanismi rimangono sfuggente in molti aspetti e impongono prosecuzione degli accertamenti ^7. La misura in cui AKI si traduce in un danno renale permanente rimane sconosciuta. La ricerca attuale suggerisce il potenziale rigenerativo per il rene è lapiù alto dopo meno gravi casi di AKI, mentre gli episodi più pronunciati o ripetute portano alla malattia renale cronica (CKD) e culminano nella malattia renale allo stadio terminale (ESRD) che richiede il trapianto salva-vita o la dialisi ^8,9. Inoltre, gli individui già affetti da insufficienza renale cronica sono ad un ancora più elevato rischio di contrarre una grave episodio di AKI ^8,9. Nel loro insieme, è chiaro che ha continuato la ricerca di base e clinica è fondamentale per comprendere, trattare e prevenire AKI.

La ricerca con modelli animali è stato determinante per apprezzare la progressione delle alterazioni locali e ambientali che si verificano durante AKI ^10. Per espandere questa comprensione e sviluppare nuove terapie, il modello animale zebrafish è stato impiegato in una varietà di modi ^11,12. I nefroni del rene zebrafish, sia l'embrione e adulti, mostrano un alto grado di conservazione con i mammiferi ^13-16. Inoltre, lesioni epiteliali nefrone in zebrafish assomiglia al processo di vertebrati superiori, per cui la distruzione locale del cellule tubulari è seguita da proliferazione intratubulare e ristabilimento di architettura nefrone ^17-19. Nell'embrione, però, ingenti danni tubulo dalle nefrotossine come cisplatino è associata a letalità ^20,21. In confronto, gli adulti zebrafish sopravvivono AKI e mostrano capacità rigenerative sostanziali nel rene. Ad esempio, dopo l'esposizione al gentamicina antibiotici aminoglicosidi, zebrafish rigenerare tubulo danno epiteliale e far crescere nuove unità nefrone così ^22-24. Mentre questi studi AKI gentamicina indotta hanno fornito preziose informazioni, la comprensione danno renale da diversi nefrotossine rimane fondamentale per apprezzare gli effetti e la risposta a diversi tipi di danni ^25.

L'embrione zebrafish, a causa della sua dimensione, trasparenza, e trattabilità genetica, ha molti vantaggi per gli studi nefrotossina <sup> 25, in cui il metodo di microiniezione ^20,21 viene utilizzato per gestire la molecola (s) per indagini. Nefroni sono formate da 24 ore dopo la fecondazione (HPF) e cominciano a filtrare il sangue di circa il 48 HPF ^26,27. Così, la rapida formazione e la funzione del rene embrionale facilita analisi sperimentale. Tuttavia, il processo di microiniezione ha sfide tecniche e non ci può essere una ripida curva di apprendimento per padroneggiare la tecnica. In questo articolo il video, si descrive come eseguire microiniezioni e fornire suggerimenti sulla risoluzione dei problemi al fine di migliorare il tasso di iniezioni di successo.

Protocol

Le procedure per lavorare con embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali presso l'Università di Notre Dame. 1. preparazione di soluzioni Fare una soluzione 50x magazzino di E3 mezzi dell'embrione mescolando 73,0 g di NaCl, 3,15 g KCl, 9.15 g CaCl 2, e 9,95 g MgSO 4 a 5 L di acqua distillata, e conservare a temperatura ambiente. Per la coltura di embrioni di zebrafish, diluire …

Representative Results

Una stazione di microiniezione istituito comprende uno stereomicroscopio, micromanipolatore e regolatore di pressione (Figura 1A). Transilluminazione della piastra iniezione è preferibile visualizzare campioni durante questa procedura (Figura 1B). Preparazione dell'ago iniezione coinvolge tirando il vetro borosilicato appropriata, seguita preparando il bordo con taglio e back-caricare l'ago fine. In modo ottimale, la punta dell'ago è smussa…

Discussion

Un svariato numero di agenti terapeutici sono stati associati con AKI ^29. Ci sono stati notevoli progressi della ricerca nella comprensione del danno indotto da molti composti individuali, come la gentamicina aminoglicosidi ³⁰ e il cisplatino chemioterapico ampiamente usato ^31,32. Alcuni cambiamenti patologici coinvolti in queste condizioni, tuttavia, rimangono oggetto di studio in corso. Una sfida emergente rimane la comprensione di come più farmaci influenzano negativamente i pazienti…

Materials

Sodium Chloride	American Bioanalytical	AB01915
Potassium Chloride	American Bioanalytical	AB01652
Calcium Chloride	American Bioanalytical	AB00366
N-Phenylthiourea (PTU)	Aldrich Chemistry	P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)	Fluka Analytical	A5040
Borosilicate glass	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60mm x 15mm	VWR	25373-085
100mm x 15mm	VWR	25373-100
(microinjection tray) 150mm x 15mm	VWR	25373-187
Low Temperature Incubator	Fischer Scientific	11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
Micrometer	Ted Pella, Inc.	2280-24