Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

Summary

lesões renais decorrentes de nefrotoxinas, que incluem drogas que variam de antibióticos para quimioterápicos, pode resultar em doenças complexas, cuja patogênese permanece incompletamente compreendida. Este protocolo demonstra como peixe-zebra pode ser utilizado para modelar doenças destas condições, que podem ser aplicados para a identificação de medidas renoprotetor.

Abstract

Os rins são suscetíveis a danos causados ​​por exposição a produtos químicos que filtram da corrente sanguínea. Isso pode levar a lesões de órgãos associada a um rápido declínio da função e desenvolvimento da síndrome clínica conhecida como lesão renal aguda (LRA) renal. Os agentes farmacológicos usados ​​para tratar condições médicas que variam de infecção bacteriana para cancro, quando administrados individualmente ou em combinação com outras drogas, pode iniciar LRA. Os peixes-zebra são um modelo animal útil para o estudo dos efeitos químicos sobre a função renal, in vivo, uma vez que formam um rim embrionário composta de unidades de nefrónios funcionais que são conservados com vertebrados superiores, incluindo seres humanos. Além disso, o peixe-zebra pode ser utilizado para realizar telas genéticos e químicas, que fornecem oportunidades para elucidar as facetas celulares e moleculares de AKI e desenvolver estratégias terapêuticas tais como identificação de moléculas nefroprotector. Aqui, demonstramos como microinjeção noembrião do peixe-zebra pode ser utilizado como um paradigma para estudos nefrotoxina.

Introduction

LRA é uma perda abrupta da função renal que pode conduzir a consequências devastadoras saúde ^1. AKI é uma questão importante de saúde em todo o mundo devido à sua alta incidência de aproximadamente 20% entre os pacientes hospitalizados, com taxas ainda maiores de 30-50% em casos de cuidados críticos e os idosos, e as taxas de mortalidade de 50-70% ^1-3. Infelizmente, a prevalência de AKI tem vindo a aumentar e está projetado para aumentar ainda mais durante a próxima década, em parte devido à diversidade de fatores que podem induzir AKI, que incluem stress pós-operatório, isquemia e exposição a nefrotoxinas como antibióticos e ⁴ fármacos quimioterapêuticos.

LRA envolve dano celular súbita dentro do rim, que ocorre comumente na nefrónios, que são as unidades funcionais essenciais, e são constituídos por um filtro de sangue e um túbulo segmentada que drena a urina em condutas de recolha central ^1. Quando um número significativo de néfrons sãodanificada durante LRA, os efeitos imediatos incluem uma interrupção na depuração de resíduos a partir da circulação, e reduzida ou abolida através de fluxo de fluido nefrónios devido à obstrução de células mortas e moribundas ^1. Ao longo do tempo, a obstrução tubular pode levar à degeneração de nefrónios inteiras, o que reduz de forma permanente da função renal ^1. Alterações fisiológicas no rim seguintes AKI também envolvem eventos inflamatórios que podem levar a cicatrizes crônica ^1.

Apesar destes resultados, néfrons têm alguma capacidade de se submeter a regeneração após AKI que reconstitui a ^5,6 epitélio tubular. Embora tenha havido uma compreensão molecular crescente de regeneração néfron, os mecanismos são ainda imperceptíveis em muitos aspectos e necessitam continuou investigação ^7. O grau em que LRA resulta em dano renal permanente também permanece desconhecida. A investigação actual sugere o potencial de regeneração para o rim é omaior seguinte casos menos graves de AKI, enquanto episódios mais pronunciados ou repetidas levar à doença renal crônica (DRC) e culminam com doença renal terminal (DRT) que requer transplante ou diálise ^8,9 salva-vidas. Além disso, os indivíduos que já sofrem de doença renal crônica têm um risco ainda maior de contrair um episódio grave de AKI ^8,9. Tomados em conjunto, é claro que continuou pesquisa básica e clínica é vital para compreender, tratar e prevenir a AKI.

A pesquisa com modelos animais tem sido fundamental para apreciar a progressão de alterações locais e ambientais que ocorrem durante AKI ^10. Para expandir este entendimento, bem como desenvolver novas terapias, o modelo animal peixe-zebra foi empregada em uma variedade de formas ^11,12. Os nefrónios do rim do peixe-zebra, tanto no embrião e do adulto, apresentam um elevado grau de conservação com mamíferos ^13-16. Além disso, lesão epitelial nephron em zebrafish se assemelha ao processo em vertebrados superiores, em que a destruição local de células tubulares é seguida pela proliferação intratubular e restabelecimento da arquitectura nefrónios ^17-19. No embrião, no entanto, grandes danos túbulo das nefrotoxinas como cisplatina está associado com letalidade ^20,21. Em comparação, os adultos de peixe-zebra sobreviver AKI e exibem capacidades regenerativas substantivas no rim. Por exemplo, após a exposição ao antibiótico aminoglicósido gentamicina, peixe-zebra regenerar dano epitelial dos túbulos e crescer novas unidades de nefrónios bem como ^22-24. Embora esses estudos LRA induzida por gentamicina ter fornecido informações valiosas, entendendo dano renal de diversas nefrotoxinas permanece crítica para apreciar os efeitos e resposta a diferentes tipos de danos ^25.

O embrião de peixe-zebra, devido ao seu tamanho, transparência e rastreabilidade genética, tem muitos benefícios para estudos nefrotoxina <sup> 25, em que o método de microinjecção ^20,21 é utilizado para administrar a molécula (s) para a investigação. Néfrons são formados por 24 horas após a fertilização (hpf) e começar a filtrar o sangue por cerca de 48 hpf ^26,27. Assim, a rápida formação e a função do rim embrionário facilita a análise experimental. No entanto, o processo de microinjeção tem desafios técnicos e não pode haver uma curva de aprendizagem para dominar a técnica. Neste artigo de vídeo, que descrevem como realizar e proporcionar microinjections dicas de resolução de problemas, a fim de aumentar a taxa de sucesso de injecções.

Protocol

Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Notre Dame. 1. Preparação de Soluções Adicione uma solução de estoque de 50x E3 meios embrião por mistura de 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl2, e 9,95 g de MgSO4 em 5 L de água destilada, e armazenamento à temperatura ambiente. Para a cultura de embriões de peixe-zebra, dilui-se a…

Representative Results

Uma estação de microinjecção configurar inclui um estereomicroscópio, micromanipulador e regulador de pressão (Figura 1A). Transiluminação da placa de injecção é preferível para visualizar amostras durante este procedimento (Figura 1B). Preparação da agulha de injecção implica puxar o vidro de borosilicato apropriado, seguida por preparação da borda de corte e, finalmente, com back-carregar a agulha. Optimamente, a ponta da agulha é ch…

Discussion

Um número diverso de agentes terapêuticos têm sido associados com LRA ^29. Tem havido avanços significativos na compreensão de investigação do dano induzido por muitos compostos individuais, tais como a gentamicina aminoglicósido ³⁰ e a cisplatina quimioterapêutico largamente utilizado ^31,32. Algumas alterações patológicas envolvidos nestas condições, no entanto, continuar a ser objecto de estudo em curso. Um desafio emergente continua a compreensão de como múltiplas droga…

Materials

Sodium Chloride	American Bioanalytical	AB01915
Potassium Chloride	American Bioanalytical	AB01652
Calcium Chloride	American Bioanalytical	AB00366
N-Phenylthiourea (PTU)	Aldrich Chemistry	P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)	Fluka Analytical	A5040
Borosilicate glass	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60mm x 15mm	VWR	25373-085
100mm x 15mm	VWR	25373-100
(microinjection tray) 150mm x 15mm	VWR	25373-187
Low Temperature Incubator	Fischer Scientific	11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
Micrometer	Ted Pella, Inc.	2280-24