Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

Summary

blessures rénales survenant à partir de néphrotoxines, qui comprennent des médicaments allant des antibiotiques aux agents chimiothérapeutiques, peuvent entraîner des troubles complexes dont la pathogénie reste mal compris. Ce protocole montre comment zebrafish peut être utilisé pour la modélisation de la maladie de ces conditions, qui peuvent être appliquées à l'identification des mesures néphroprotecteurs.

Abstract

Les reins sont susceptibles de nuire à l'exposition aux produits chimiques qu'ils filtrent de la circulation sanguine. Cela peut conduire à des blessures d'organes associée à une diminution rapide de la fonction rénale et le développement du syndrome clinique connu comme l'insuffisance rénale aiguë (IRA). Les agents pharmacologiques utilisés pour traiter des circonstances médicales allant de l'infection bactérienne au cancer, lorsqu'ils sont administrés seuls ou en combinaison avec d'autres médicaments, peuvent initier AKI. Zebrafish sont un modèle animal utile pour étudier les effets chimiques sur la fonction rénale in vivo, car ils forment un rein embryonnaire composé d'unités fonctionnelles du nephron qui sont conservés avec les vertébrés supérieurs, y compris les humains. En outre, le poisson zèbre peut être utilisé pour réaliser des écrans génétiques et chimiques, qui permettent d'élucider les aspects cellulaires et moléculaires de AKI et élaborer des stratégies thérapeutiques telles que l'identification de molécules néphroprotecteurs. Ici, nous montrons comment microinjection dans leembryon de poisson zèbre peut être utilisé comme un paradigme pour les études de néphrotoxine.

Introduction

AKI est une perte soudaine de la fonction rénale qui peut conduire à des conséquences dévastatrices sur la santé ^1. AKI est un important problème de santé dans le monde entier en raison de sa forte incidence d'environ 20% chez les patients hospitalisés, avec des taux encore plus élevés de 30-50% dans les cas de soins intensifs et les personnes âgées, et les taux de 50-70% ^1-3 de mortalité. Malheureusement, la prévalence de l'AKI a augmenté et devrait grimper encore au cours de la prochaine décennie, en partie à cause de la diversité des facteurs qui peuvent induire des AKI, qui comprennent le stress post-opératoire, l'ischémie, et l'exposition à néphrotoxines tels que les antibiotiques et des médicaments chimiothérapeutiques ^4.

Insuffisance rénale aiguë implique des lésions cellulaires soudaine dans le rein, se produisant fréquemment dans néphrons, qui sont les unités fonctionnelles essentielles, et sont constitués d'un filtre à sang et un tube segmentée qui draine l' urine dans les conduits collecteurs centraux ^1. Quand un nombre important de néphrons sontendommagé pendant AKI, les effets immédiats comprennent une interruption de la clairance des déchets de la circulation, et l' écoulement de fluide réduite ou abrogée par néphrons en raison de l' obstruction de morts et mourants cellules ^1. Au fil du temps, l' obstruction tubulaire peut conduire à une dégénérescence des néphrons entières, ce qui réduit de façon permanente la fonction rénale ^1. Altérations physiologiques dans le rein suivantes AKI impliquent également des événements inflammatoires complexes qui peuvent conduire à la cicatrisation chronique ^1.

En dépit de ces résultats, les néphrons ont une certaine capacité à subir la régénération après AKI qui reconstitue l'épithélium tubulaire ^5,6. Bien qu'il y ait eu une compréhension moléculaire croissante des néphrons régénération, les mécanismes restent insaisissables à bien des égards et nécessitent la poursuite des recherches ^7. Le degré auquel les résultats AKI dans les lésions rénales permanentes reste également inconnu. Les recherches actuelles suggèrent le potentiel de régénération pour le rein est lele plus élevé suivant les cas moins graves de AKI, alors que les épisodes plus prononcés ou répétées conduisent à une maladie rénale chronique (CKD) et aboutir à phase terminale de maladie rénale (STIR) qui nécessite une transplantation ou une dialyse ^8,9 sauver la vie. En outre, les personnes souffrant déjà de CKD sont à un risque encore plus élevé de contracter un épisode sévère de AKI ^8,9. Pris ensemble, il est clair que la poursuite de la recherche fondamentale et clinique est essentiel de comprendre, traiter et prévenir AKI.

La recherche avec des modèles animaux a joué un rôle dans l' appréciation de la progression des altérations locales et environnementales qui se produisent pendant AKI ^10. Pour développer cette compréhension ainsi que de développer de nouvelles thérapies, le modèle animal zebrafish a été utilisé dans une variété de façons ^11,12. Les néphrons du rein zebrafish, à la fois dans l'embryon et l' adulte, présentent un degré élevé de conservation des mammifères ^13-16. En outre, une lésion épithéliale néphron dans zebrafish ressemble au processus chez les vertébrés supérieurs, de sorte que la destruction locale de cellules tubulaires est suivie par une prolifération intratubulaire et le rétablissement de l' architecture des néphrons ^17-19. Dans l'embryon, cependant, d' importants dégâts tubule des néphrotoxines comme le cisplatine est associé à létalité ^20,21. Par comparaison, les adultes survivent AKI poisson zèbre et présentent des capacités de régénération de fond dans le rein. Par exemple, suite à une exposition à l'antibiotique gentamicine aminoglycoside, zebrafish régénérer tubule lésions épithéliales et développer de nouvelles unités de néphrons ainsi ^22-24. Bien que ces études AKI induite par la gentamicine ont fourni des renseignements précieux, la compréhension des lésions rénales à partir de divers néphrotoxines reste critique pour apprécier les effets et la réponse aux différents types de dommages ^25.

L'embryon de poisson zèbre, en raison de sa taille, la transparence et la traçabilité génétique, présente de nombreux avantages pour les études de néphrotoxine <sup> 25, où la méthode de microinjection ^20,21 est utilisé pour administrer la molécule (s) pour enquête. Néphrons sont formés par 24 heures après la fécondation (HPF) et commencent à filtrer le sang d'environ 48 HPF ^26,27. Ainsi, la formation rapide et la fonction du rein embryonnaire facilite l'analyse expérimentale. Cependant, le processus de microinjection a des défis techniques et il peut y avoir une courbe d'apprentissage abrupte à la maîtrise de la technique. Dans cet article, vidéo, nous décrivons comment effectuer microinjections et de fournir des conseils de dépannage afin d'améliorer le taux d'injections réussies.

Protocol

Les procédures pour travailler avec des embryons de poisson zèbre décrits dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Université de Notre Dame. 1. Préparation des solutions Faire une solution 50x stock de E3 médias d'embryons en mélangeant 73,0 g NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl 2, et 9,95 g MgSO 4 à 5 litres d'eau distillée, et conserver à la température ambiante. P…

Representative Results

Une station de microinjection mis en place comprend un stéréomicroscope, micromanipulateur et régulateur de pression (figure 1A). Transillumination de la plaque d'injection est préférable d'afficher des échantillons au cours de cette procédure (figure 1B). Préparation de l'aiguille d'injection consiste à tirer le verre borosilicate approprié, suivie par la préparation de l'arête de coupe et, enfin, avec chargement par l&#3…

Discussion

Un nombre varié d'agents thérapeutiques ont été associés à AKI ^29. Il y a eu des progrès importants travaux de recherche dans la compréhension des dommages induits par de nombreux composés individuels, tels que la gentamicine aminoglycoside ³⁰ et le cisplatine chimiothérapeutique largement utilisé ^31,32. Certains changements pathologiques impliqués dans ces conditions, cependant, restent l'objet d'une étude en cours. Un défi émergent reste à comprendre comment…

Materials

Sodium Chloride	American Bioanalytical	AB01915
Potassium Chloride	American Bioanalytical	AB01652
Calcium Chloride	American Bioanalytical	AB00366
N-Phenylthiourea (PTU)	Aldrich Chemistry	P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)	Fluka Analytical	A5040
Borosilicate glass	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60mm x 15mm	VWR	25373-085
100mm x 15mm	VWR	25373-100
(microinjection tray) 150mm x 15mm	VWR	25373-187
Low Temperature Incubator	Fischer Scientific	11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
Micrometer	Ted Pella, Inc.	2280-24