Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model
Summary
kemoterapötik antibiyotik arasında değişen ilaçlar yer alır nephrotoxins, kaynaklanacak böbrek yaralanmaları, kimin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır karmaşık bozuklukları oluşabilir. Bu protokol, zebra balığı böbrek koruyucu önlemlerin tanımlanması için uygulanabilir, bu koşullar, hastalık modelleme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Abstract
Böbrekler onlar kan filtrelemek kimyasallara maruz zarar yatkındır. Bu böbrek fonksiyonu ve akut böbrek hasarı (ABH) olarak bilinen klinik sendrom gelişiminde hızlı bir düşüş ile ilişkili organ hasarına yol açabilir. Farmakolojik maddeler tek tek uygulandığında bakteriyel enfeksiyondan kanseri kadar sağlık durumları tedavi etmek için kullanılabilir ya da başka ilaçlar ile kombinasyon halinde, AKI başlatabilir. Balığı onlar insanları da kapsayan yüksek omurgalıların ile korunan nefron işlevsel birimler oluşan bir embriyonik böbrek formu olarak yararlı bir hayvan modeli, in vivo olarak böbrek fonksiyonu kimyasal etkilerini incelemek için vardır. Dahası, zebra balığı AKI hücresel ve moleküler yönlerini aydınlatmak ve bu tür nefrokoruyucu moleküllerin kimlik olarak tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için fırsatlar sağlayan genetik ve kimyasal ekranlar, gerçekleştirmek için kullanılabilir. Burada, biz içine nasıl mikroenjeksiyon göstermekzebra balığı embriyo Nephrotoxin çalışmaları için bir paradigma olarak kullanılabilir.
Introduction
AKI yıkıcı sağlık sonuçları 1 yol açabilir böbrek fonksiyonlarının ani bir kayıptır. AKI daha yüksek kritik bakım olgularında% 30-50 oranları ve yaşlı, ve% 50-70 1-3 mortalite oranları ile, bağlı yatan hastalarda yaklaşık% 20 yüksek insidansı dünya çapında önemli bir sağlık sorunudur. Ne yazık ki, AKI prevalansı giderek artmaktadır nedeniyle, antibiyotikler gibi nephrotoxins post-operatif stres, iskemi ve maruz kalma dahil AKI neden olabilir faktörlerin çeşitliliği, kısmen, önümüzdeki on yıl içinde daha da yükselmek tahmin edilmektedir kemoterapötik ilaçlar 4.
AKI yaygın temel fonksiyonel birimler ve kan filtresi ve merkezi toplayıcı kanallarda 1 İdrarı boşaltır parçalı bir tübül oluşmaktadır nefron, ortaya çıkan, böbrek içindeki ani hücresel hasara içerir. Ne zaman nefron önemli bir kısmı vardırAKI sırasında hasar, ani etkiler ölü ve ölmekte olan hücrelerden 1 tıkanması nedeniyle nefron aracılığıyla bir dolaşımdan atık klerensinde kesinti, ve azalan veya yürürlükten kaldırılan sıvı akışını içerir. Zamanla, boru şeklindeki tıkanıklığı kalıcı böbrek fonksiyonlarını 1 azaltır tüm nefron, dejenerasyonu neden olabilir. AKI aşağıdaki böbrekte fizyolojik değişiklikler de kronik yara izi 1 yol açabilir karmaşık inflamatuar olayları içerir.
Bu sonuçların rağmen, nefron tübüler epitel 5,6 tekrar oluşturur AKI sonra rejenerasyon geçmesi için bazı kapasitesine sahiptir. Nefron rejenerasyon artan moleküler anlayış var olsa da, mekanizmalar birçok açıdan zor kalır ve soruşturma 7 devam gerektirecek. AKI kalıcı böbrek hasarı ile sonuçlanan derecesi de bilinmemektedir. Mevcut araştırma böbrek için rejeneratif potansiyeli olduğunu göstermektedirEn yüksek daha belirgin veya tekrarlanan bölüm kronik böbrek hastalığı (KBH) neden olurken, AKI daha az şiddetli Aşağıdaki hallerde ve hayat kurtarıcı nakli ya da diyaliz 8,9 gerektiren son dönem böbrek yetmezliği (SDBY) olarak birikirler. Ayrıca, zaten CKD muzdarip kişilerin AKI 8,9 şiddetli bölüm yakalanma daha yüksek bir risk altındadır. Birlikte ele alındığında, temel ve klinik araştırma, anlama tedavi ve AKI önlemek için hayati önem taşımaktadır devam ettiğini açıktır.
Hayvan modelleri ile Araştırma AKI 10 sırasında meydana gelen yerel ve çevresel değişiklikler ilerlemesini takdir vesile olmuştur. Bu anlayış genişletmek yanı sıra yeni tedaviler geliştirmek için, Zebra balığı hayvan modeli yolları 11,12 çeşitli istihdam edilmiştir. Zebra balığı böbrek nefron, embriyo ve yetişkin hem de memelilerde 13-16 ile birlikte koruma yüksek derecede gösterir. ze daha, nefron epitel hasarıbrafish tübüler hücrelerin lokal yıkımı intratubuler çoğalması ve nefron mimarisinin 17-19 yeniden kurulması izler sayede yüksek omurgalıların, süreci benzer. Embriyo, bununla birlikte, sisplatin gibi nephrotoxins kapsamlı tübül hasarı öldürücülüğü 20,21 ile ilişkilidir. Karşılaştırıldığında, zebrabalıkları yetişkinler AKI hayatta ve böbrekte maddi rejeneratif yeteneklerini sergileyecekleri. Örneğin, aminoglikozid antibiyotik gentamisin maruz kaldıktan sonra, Zebra balığı tübül epitel hasarı yeniden ve yeni nefron birimleri de 22-24 büyür. Bu gentamisin kaynaklı AKI çalışmaları farklı nephrotoxins böbrek hasarı anlamak, çok değerli bilgiler sağlamıştır olsa da etkileri ve hasar 25 farklı türde yanıt takdir için kritik kalır.
Zebra balığı embriyo nedeniyle büyüklüğü, şeffaflık ve genetik tractability için, Nephrotoxin çalışmaları için pek çok faydaları vardır <Mikroenjeksiyon 20,21 yöntemi soruşturma molekülü (ler) yönetmek için kullanılır sup> 25. Nefron 24 saat sonra döllenme (hpf) tarafından oluşturulan ve yaklaşık 48 hpf 26,27 kanı filtre başlarlar. Böylece, embriyonik böbrek hızlı oluşumu ve fonksiyonu deneysel analizini kolaylaştırır. Ancak, mikroenjeksiyon işlemi teknik zorlukları vardır ve teknik mastering için bir öğrenme eğrisi olabilir. Bu video makalede, biz microinjections gerçekleştirmek ve başarılı enjeksiyonları oranını arttırmak için sorun giderme ipuçları sağlamak açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terapötik maddelerin bir çok çeşitli sayıda AKI 29 ile ilişkilendirilmiştir. Böyle aminoglikozid gentamisin 30 ve yaygın olarak kullanılan kemoterapötik sisplatin 31,32 olarak birçok bireysel bileşikler tarafından uyarılan hasar anlaşılmasında önemli araştırma gelişmeler olmuştur. Bu koşullar dahil patolojik değişiklikler, devam eden çalışmanın konusu olmaya devam etmektedir. Bir acil zorluk birden fazla ilaç olumsuz gibi kritik bakım ortamlarında olanlar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe DP2OD008470 tarafından kısmen desteklenmiştir. Ayrıca, RAM Notre Dame Graduate School Üniversitesi tarafından sağlanan fonlarla kısmen desteklenmiştir. Biz Kök Hücre ve Notre Dame Üniversitesi Rejeneratif Tıp Biyolojik Bilimler Bölümü, Zebra balığı Araştırma Merkezi ve Merkezi kadroya teşekkür ederim. Biz özellikle böbrek biyoloji ve bu işin kendi yararlı geribildirim hakkında tartışmalar takılmak için laboratuar üyelerine teşekkür ederim.
Materials
| Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
| Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040 | |
| Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
| Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning: | |||
| 60mm x 15mm | VWR | 25373-085 | |
| 100mm x 15mm | VWR | 25373-100 | |
| (microinjection tray) 150mm x 15mm | VWR | 25373-187 | |
| Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Micrometer | Ted Pella, Inc. | 2280-24 |
Riferimenti
- Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr. Physiol. 2, 1303-1353 (2012).
- Ostermann, M. Diagnosis of acute kidney injury: kidney disease improving global outcomes criteria and beyond. Curr. Opin. Crit. Care. 20, 581-587 (2014).
- Fluck, R. J. Acute kidney: improving the pathway of care for patients and across healthcare. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 24, 511-516 (2015).
- Silver, S. A., Cardinal, H., Colwell, K., Burger, D., Dickhout, J. G. Acute kidney injury: preclinical innovations, challenges, and opportunities for translation. Can. J Kidney Health Dis. 2, 30 (2015).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. Renal stem cells: fact or science fiction?. Biochem. J. 444, 153-168 (2012).
- Li, Y., Wingert, R. A. Regenerative medicine for the kidney: stem cell prospects and challenges. Clin. Transl. Med. 2, 11 (2013).
- Romagani, P., Lasagni, L., Remuzzi, G. Renal progenitors: an evolutionary conserved strategy for kidney regeneration. Nat. Rev. Nephrol. 9, 137-146 (2013).
- Kline, J., Rachoin, J. S. Acute kidney injury and chronic kidney disease: it’s a two-way street. Ren. Fail. 35, 452-455 (2013).
- Chawla, L. S., Kimmel, P. L. Acute kidney injury and chronic kidney disease: an integrated clinical syndrome. Kidney Int. 82, 516-524 (2012).
- Sanz, A. B., Sanchez-Niño, M. D., Martìn-Cleary, C., Ortiz, A., Ramos, A. M. Progress in the development of animal models of acute kidney injury and its impact on drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 8, 879-895 (2013).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: emerging models of acute kidney injury. Curr. Pathobiol. Rep. 3, 171-181 (2015).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-1127 (2008).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (90), e51644 (2014).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J. Vis. Exp. (54), e2845 (2011).
- Palmyre, A., et al. Collective epithelial migration drives kidney repair after acute injury. PLoS One. 9, e101304 (2014).
- Fogelgren, B., et al. Exocyst Sec10 protects renal tubule cells from injury by EGFR/MAPK activation and effects on endocytosis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 307, F1334-F1341 (2014).
- Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervox, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 288, F923-F929 (2005).
- Cosentino, C. C., Roman, B. L., Drummond, I. A., Hukriede, N. A. Intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury. J. Vis. Exp. (42), e2079 (2010).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
- Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-101 (2011).
- McCampbell, K. M., Springer, K. N., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cell Int. , 547636 (2015).
- Sharma, P., Sharma, S., Patial, V., Singh, D., Padwad, Y. S. Zebrafish (Danio rerio): a potential model for nephroprotective drug screening. Clinical Queries: Nephrol. 3, 97-105 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Hanke, N., et al. ‘Zebrafishing’ for novel genes relevant to the glomerular filtration barrier. Biomed. Res. Int. 2013, 658270 (2013).
- Kane-Gill, S. L., Goldstein, S. L. Drug-induced acute kidney injury: a focus on risk assessment for prevention. Crit. Care Clin. 31, 675-684 (2015).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2010).
- Ozkok, A., Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed. Res. Int. 2014, 967826 (2014).
- Perazella, M. A., Moeckel, G. W. Nephrotoxicity from chemotherapeutic agents: clinical manifestations, pathobiology, and prevention/therapy. Semin. Nephrol. 30, 570-581 (2010).
- Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Recent advances in elucidating the genetic mechanisms of nephrogenesis using zebrafish. Cells. 4, 218-233 (2015).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl. Res. 163, 65-78 (2014).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J. Vis. Exp. (89), e51604 (2014).
- Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Combinatorial regulation of novel erythroid gene expression in zebrafish. Exp. Hematol. 36, 424-432 (2008).
- McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr. Patterns. 16, 104-113 (2014).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev. Biol. 386, 111-122 (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota and zeta. Dev. Biol. 396, 183-200 (2014).
- Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev. Biol. 399, 100-116 (2015).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res. C Embryo Today. 93, 268-280 (2011).
- Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Congenital and acute kidney disease: translational research insights from zebrafish chemical genetics. Gen. Med. 1, 112 (2013).
- Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high-throughput using zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (93), e52063 (2014).
- Peng, H. C., Wang, Y. H., Wen, C. C., Wang, W. H., Cheng, C. C., Chen, Y. H. Nephrotoxicity assessments of acetaminophen during zebrafish embryogenesis. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 151, 480-586 (2010).
- Wu, T. S., Yang, J. J., Yu, F. Y., Liu, B. H. Evaluation of nephrotoxic effects of mycotoxins, citrinin and patulin, on zebrafish (Danio rerio) embryos. Food Chem. Toxicol. 50, 4398-4404 (2012).
- Ding, Y. J., Chen, Y. H. Developmental nephrotoxicity of aristolochic acid in a zebrafish model. Toxicol. Appl. Pharmacol. 261, 59-65 (2012).
- Zennaro, C., et al. Podocyte developmental defects caused by adriamycin in zebrafish embryos and larvae: a novel model of glomerular damage. PLoS One. 9, e98131 (2014).
- Ding, Y. J., Sun, C. Y., Wen, C. C., Chen, Y. H. Nephroprotective role of resveratrol and ursolic acid in aristolochic acid intoxicated zebrafish. Toxins. 7, 97-109 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (27), e1115 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J. Vis. Exp. (96), e52540 (2015).
