ग्रेगैट-रिएक्टिव इम्यूनिटी को रोकते हुए विनियामक मैक्रोफेज का कार्यात्मक लक्षण वर्णन
Summary
मैक्रोफेज हेमेटोपोएटिक प्रणाली की प्लास्टिक कोशिकाएं हैं जो सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा और होमोस्टैसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। इस रिपोर्ट में, हम इन विट्रो तकनीकों में प्रथितिक रूप से अनुकूलित और कार्यात्मक रूप से भ्रष्टाचार-घुसपैठ कर रहे विनियामक मैक्रोफेज का वर्णन करते हैं जो संक्रमित शर्तों के तहत प्रत्यारोपित अंग में जमा होते हैं।
Abstract
प्रत्यारोपित अंगों में मैक्रोफेज संचय लंबे समय से ऑलोग्राम अस्वीकृति 1 की एक विशेषता के रूप में मान्यता प्राप्त है। इम्यूनोजेनिक मोनोसाइट्स, ट्रांसप्लांटेशन के तुरंत बाद ऑलोग्राफ़्ट में घुसपैठ, प्रत्यारोपित अंग के खिलाफ एक भ्रष्टाचार प्रतिक्रियात्मक प्रतिक्रिया माउंट करता है और अंग अस्वीकृति 2 आरंभ करता है। हाल के आंकड़ों से पता चलता है कि दबदबा मैक्रोफेज सफल दीर्घकालिक प्रत्यारोपण 3 की सुविधा देते हैं और ट्रांसप्लांटेशन सहिष्णुता 4 के शामिल होने के लिए आवश्यक हैं। यह मैक्रोफेज ऑनटोजनी, एक्टिवेशन और फ़ंक्शन की एक बहुआयामी अवधारणा का सुझाव देती है, जो मैक्रोफेज फ़ंक्शन 5 के अलगाव और विश्लेषण के लिए एक नया रोडमैप की मांग करता है। मैक्रोफेज के प्लास्टिसिटी के कारण, टिशू पर्यावरण पर निर्भर करते हुए मैक्रोफेज को अलग और रूपांतरित करने के लिए एक पद्धति प्रदान करना और विभिन्न परिदृश्यों के अनुसार अपने कार्यों को परिभाषित करना आवश्यक है। यहाँ, हम descriभ्रष्टाचार-घुसपैठ मैक्रोफेज के प्रतिरक्षा लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल और इन विधियों में हम सीडी 8 + टी प्रसार को रोकना और इन्हो में सीडी 4 + फॉक्सपेक्स + टे्रग विस्तार को बढ़ावा देने के लिए कार्यशील रूप से अपनी क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया।
Introduction
टी-सेल प्रतिक्रियाओं को व्यवस्थित करने की उनकी क्षमता के अनुसार, यह प्रोटोकॉल कार्डियक ऑलोग्राफ्ट से पृथक ऊतक-घुसपैठ मैक्रोफेज के कार्य का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो तकनीकों में वर्णित है। साहित्य में विस्तृत रूप से वर्णन किया गया है, प्रवाह कोशिका के साथ संयोजन में फ्लोरोसेंट सेल-ट्रैकिंग रंजक, इन विट्रो और विवो में विशिष्ट सेल प्रकार के दमनकारी फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं । इन विट्रो में लिम्फोसाइट प्रोलीफ्रेशन की निगरानी के लिए हमारे प्रोटोकॉल कार्बोक्सीफ्लोरेससेन सुक्विनिमिडिल एस्टर (सीएफएसई) विधि का अनुसरण करता है।
जब एक सीएफएसई-लेबल वाला सेल विभाजित होता है, तो उसकी संतान कार्बोक्सीफ्लोरेससिन-टैग अणुओं के आधे से ज्यादा संख्या प्राप्त करती है। प्रवाह कोशिकामितीय द्वारा सेल प्रतिदीप्ति में संबंधित कमी का उपयोग सेल डिवीज़न के आकलन के लिए किया जा सकता है, टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को व्यवस्थित करने के लिए दबदबा मैक्रोफेज की क्षमता की निगरानी। चूंकि सीएफएसई एक फ्लोरोसिसिन आधारित डाई है, इसलिए यह ब्र के साथ संगत हैअन्य फ्लोरोरेमॉम्स की ओड रेंज, इसे बहु-रंग प्रवाह साइटोमेट्री पर लागू करते हैं। Phenotyping के लिए फ्लोरीरोमों की उचित पसंद भी अत्यधिक वर्णक्रमीय ओवरलैप और एंटीबॉडी पॉजिटिव कोशिकाओं को पहचानने में अक्षमता से महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से सीएफएसई 7 जैसी प्रोटीन डाईस के साथ।
वैकल्पिक तकनीकों पर फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करने के कई फायदे हैं जो सेल प्रसार को मापते हैं, जैसे थाइमिडाइन इनकॉर्पोरेशन परख, जो रेडियोलैबैड थिइमिडीन (टीडीआर) 8 का उपयोग करता है। यह परख त्रयीकृत थाइमिडीन ( 3 एच-टीडीआर) का उपयोग करता है जो कि mitotic कोशिका विभाजन के दौरान क्रोमोसोमल डीएनए के नए किस्में शामिल होता है। इस परख से जुड़े एक सुरक्षा संबंधी चिंता रेडियोसोटोपों का उपयोग है, क्योंकि सेल डिवीजन की सीमा निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं से पुनः प्राप्त डीएनए में रेडियोधर्मिता को मापने के लिए एक बिच्छू बीटा-काउंटर का उपयोग किया जाता है। मेथोडोलॉजिकल, ट्रिकीटेड थिमिडीन गधेएई पर्याप्त चिकित्सीय प्रयोगशाला बाधाओं जैसे कि कम संख्या में कोशिकाओं और धुंधला हो जाने के बाद देरी से विश्लेषण के लिए पर्याप्त लचीला नहीं है। इसके विपरीत, सीएफएसई धुंधला सेल प्रसार को रोकने के लिए और महत्वपूर्ण सक्रियण मार्करों जैसे कि सीडी 6 9 , एचएलए-डीआर और सीडी 25 9 में हस्तक्षेप करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, विभिन्न तरीकों को ट्रैक करने के लिए कई रंगों का प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से बहुरंगा अध्ययन में प्रत्येक पद्धति के फायदे और सीमाओं को समझना, सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल उन तरीकों का वर्णन करता है जो हम हृदय प्रत्यारोपण के एक प्रयोगात्मक मूरीन मॉडल में भ्रष्टाचार-घुसपैठ वाले मायलोयॉइड सेल सबसेट को अनियंत्रित करते थे, जो कि अलग-अलग मुरीइन प्रयोगात्मक मॉड?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम माउंट सिनाई में रिसर्च एक्सलंस के फ्लो साइटोमेट्री, माइक्रोस्कोरी और बायो-रिपॉजिटरी / पैथोलॉजी सेंटर के तकनीकी योगदान को स्वीकार करते हैं। यह कार्य COST एक्शन बीएम -1305 द्वारा समर्थित था: सेल टूलेरोजेनिक चिकित्सा (एक तथ्य), माउंट सिनाई रिकानती / मिलर ट्रांसप्लांटेशन इंस्टीट्यूट डेवलपमेंट फंड, फोकस और एक्सेरेट करने के लिए एक्शन, सेमिनियो डी सिएन्सिया ए इनोवेशन एसएएफ 2013-48834-आर और एसएएफ2016-80031-आर JO
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
Riferimenti
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