Viene presentato un protocollo per la coltura cellulare di macrofagi derivati da monociti umani differenziati da fattori stimolanti le colonie di macrofagi (M-CSF). Il protocollo utilizza la crioconservazione dei monociti accoppiata alla loro differenziazione di massa in macrofagi. Quindi i macrofagi raccolti possono essere seminati in pozzetti di coltura alle densità cellulari richieste per l'esecuzione degli esperimenti.
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Articolo metodologico
Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Viene presentato un protocollo per la coltura cellulare di macrofagi derivati da monociti umani differenziati da fattori stimolanti le colonie di macrofagi (M-CSF). Per l'inizio degli esperimenti, i monociti freschi o congelati vengono coltivati in fiasche per 1 settimana con M-CSF per indurre la loro differenziazione in macrofagi. Quindi, i macrofagi possono essere raccolti e seminati in pozzetti di coltura alle densità cellulari richieste per l'esecuzione degli esperimenti. L'uso di un numero definito di macrofagi piuttosto che di un numero definito di monociti per avviare colture di macrofagi per esperimenti produce colture di macrofagi in cui la densità cellulare desiderata può essere raggiunta in modo più coerente. L'uso di monociti crioconservati riduce la dipendenza dalla disponibilità del donatore e produce colture di macrofagi più omogenee.
Introduzione
Lo studio dei macrofagi in coltura è un modello utile per comprendere la funzione di queste cellule nell'infiammazione come avviene nelle placche aterosclerotiche. Quando la ricerca si concentra sulle malattie umane che coinvolgono i macrofagi, è utile studiare i macrofagi umani primari piuttosto che i macrofagi non umani per evitare differenze di specie. Inoltre, gli effetti della trasformazione cellulare possono essere evitati utilizzando macrofagi primari piuttosto che linee cellulari di macrofagi. A questo scopo, i macrofagi differenziati dai monociti isolati dal sangue umano servono come mezzo per ottenere macrofagi umani primari.
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Protocollo
Leucaferesi è stata effettuata sotto protocollo di ricerca di un soggetto umano approvato da un National Institutes of Health revisione istituzionale bordo.
1. Isolamento e Crioconservazione dei monociti
- Ottenere cellule mononucleate da leucaferesi di donatori umani, e arricchire monociti dal continuo controcorrente centrifugazione dilavamento delle cellule mononucleari come descritto nei riferimenti 7,8. Ottenere circa 100 x 10 6 cellule elutriated (circa 80 - 90% monociti) in tampone elutriation specificato dal costruttore. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- monociti centrifuga in ....
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Risultati
La vitalità dei monociti freschi o crioconservati era superiore al 95%, come determinato con Trypan Blue colorazione 9. Figura 1 e Figura 2 confronta ad ingrandimenti inferiori e superiori, rispettivamente, l'andamento di fresco e crioconservato (cioè, congelato) differenziazione dei monociti in macrofagi. Si noti che il fresco confrontato con monociti crioconservati mostrano una sottopopolazione di differenziare .......
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Discussione
Generazione di tipi definiti macrofagi può chiarire alcuni dei risultati contrastanti ottenuti dai ricercatori nello studio della biologia dei macrofagi. L'uso di varie condizioni di coltura e fattori di differenziazione per generare macrofagi umani primari possono portare a tipi molto diversi macrofagi, un fatto che non può essere apprezzata dal ricercatore. Ad esempio, i macrofagi a volte sono generate da monociti umani non usando il siero, siero umano da solo, siero umano integrato con M-CSF, FBS da solo, o FBS c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il Dipartimento di Medicina Trasfusionale, Centro Clinico, National Institutes of Health, ha fornito monociti elutriati. Questo lavoro è stato supportato dal Programma di ricerca intramurale, dal National Heart, Lung, and Blood Institute, dal National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra di coltura a 12 pozzetti Cellbind | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR, matraccio T-75, coltura tissutale trattata | Greiner Bio-One North America | 658157 | |
| terreno di coltura RPMI 1640 | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | riscaldato a 37 ° C |
| L-Glutammina | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cryovial | Thermo Scientific | ||
| DPBS senza Ca2+ e Mg2+ | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0,25% tripsina-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Provetta conica in polipropilene da 50 ml | Falcon | 352070 | |
| Trypan Blue | Lonza | 17-942E | |
| Emocitometro a luce intensa migliorato Neubauer | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| Congelamento cellulare CoolCell LX contenitore | BioCision | BCS-405 | anche altri contenitori di congelamento dovrebbero essere adeguati per questa fase |
| Sistema di stoccaggio dell'azoto liquido, CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | qualsiasi serbatoio di azoto liquido dovrebbe essere adeguato |
Riferimenti
- Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Front. Immunol. 5, 683(2014).
- Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages ....
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Ristampe e permessi
