Isolatie van Perivasculaire Multipotent Precursor Cell Populaties van de Mens Cardiac Tissue
Summary
Menselijk hartweefsel herbergt multipotente perivasculaire precursor celpopulaties die geschikt zijn voor myocard regeneratie kunnen zijn. De hier beschreven techniek maakt de gelijktijdige isolatie en zuivering van twee multipotente stromale cel populaties geassocieerd met natieve bloedvat, dat wil zeggen CD146 + CD34 – pericyten en CD34 + CD146 – adventitia-cellen van de menselijke hartspier.
Abstract
Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34– pericytes and vascular CD34+CD146– adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.
Introduction
Het hart is lang beschouwd als een post-mitotische orgaan. Echter, recente studies de aanwezigheid van cardiomyocyt omzet beperkt bij volwassen menselijk hart 1 aangetoond. Inheemse stam / voorlopercellen met cardiomyocyt differentiatie potentieel zijn ook geïdentificeerd binnen het myocard bij volwassen knaagdieren en menselijke harten, met inbegrip van Sca-1 +, c-kit +, cardiosphere-vorming, en het meest recent, perivasculaire voorlopercellen 2,3. Deze cellen zijn aantrekkelijke kandidaten voor therapieën die gericht zijn op verbetering van cardiale herstel / regeneratie via cel transplantatie of stimulatie van in-situ proliferatie.
Mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) zijn geïsoleerd uit bijna alle menselijke weefsels 4,5 Klinische proeven van de therapeutische toepassingen van MSC zijn uitgevoerd voor meerdere pathologische omstandigheden uitgevoerd zoals hart- reparatie 6, graft-versus-host ziekte 7 </sup> En levercirrose 8. Gunstige effecten zijn toegeschreven aan het vermogen van MSCs tot: huis aan ontstekingsplaatsen 9; differentiëren in verschillende celtypes 10; scheiden pro-herstellende moleculen 11; en moduleren gastheer immuunreacties 12. De isolatie van MSC's is van oudsher vertrouwd op hun preferentiële hechting aan plastic substraten. De resulterende celpopulatie is typisch aanmerkelijk heterogeen 13. Van door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met een combinatie van essentiële perivasculaire celmerkers, konden wij isoleren en zuiveren van een multipotente MSC-achtige precursor populatie (- / CD34 – / CD45 – – / CD56 CD146 + / CD31) geweest meerdere menselijke weefsels waaronder volwassen skeletspier en wit vet 14.
Er is aangetoond perivasculaire cel bevolking in diverse niet-cardiale weefsels stam / voorlopercellen cel eigenschappen van een hebbennd worden onderzocht voor klinisch gebruik bij de cardiovasculaire instelling. Pericyten, een van de meest bekende perivasculaire cel subsets, een heterogene populatie die verschillende pathofysiologische functies, waaronder de ontwikkeling van nieuwe vaten 15 te spelen, de regulatie van de bloeddruk 16 en onderhouden van vasculaire integriteit 17,18. Zoals getoond in verschillende weefsels, specifieke subgroepen van pericytes native uiten MSC antigenen en hun MSC-achtige fenotypes in primaire cultuur in stand te houden na FACS zuivering 14. Bovendien zijn deze cellen die stabiel behouden hun lange termijn fenotypes binnen de cultuur en vertonen multi-lijn differentiatie potentieel, vergelijkbaar met MSC's 19,20. Deze resultaten suggereren dat pericytes zijn een van de oorsprong van de ongrijpbare MSC 14. Het therapeutisch potentieel van pericyten aangetoond met een vermindering van myocardiale littekenvorming en verbeterde hartfunctie na transplantatie in ischemisch gewondenharten 21. Onlangs hebben we met succes gezuiverd pericyten van de menselijke hartspier en koos MSC-achtige fenotypen en multipotent (adipogenese, chondrogenese en osteogenese) het ontbreken van skelet myogenesis 3. Bovendien vertoonden myocardiale pericyten cardiomyogene differentiële potentie en angiogene capaciteit vergeleken met tegenhangers gezuiverd van andere organen.
Een tweede populatie van multipotente perivasculaire stam / progenitorcellen, de adventitia cel, is geïsoleerd uit menselijke aderen op basis van positieve CD34 expressie 22. Veneuze adventitia-cellen is aangetoond dat potentiële klonale, mesodermale differentiatievermogen en pro-angiogene potentieel in vitro hebben. Transplantatie van deze cellen in het ischaemisch gewonden harten van muizen resulteerde in een afname van interstitiële fibrose, een toename van angiogenese en myocardiale bloedstroom, verminderde ventriculaire dilatie, en verhoogde cardiale ejectiefractie 23. Interessant is dat vetweefsel adventitia cellen is aangetoond dat CD34 expressie te verliezen en upregulate CD146 expressie in cultuur in reactie op angiopoietine II behandeling, wat suggereert dat de goedkeuring van een pericyte fenotype met stimulering 24. In het hart, maar de adventitia celpopulatie nog niet prospectief gezuiverd door FACS en / of goed gekarakteriseerd. Gebruik makend van de cel isolatie procedures in de volgende gedeelten worden beschreven, zijn we momenteel karakteriseren myocard adventitia cellen en het onderzoeken van hun potentieel voor regeneratieve toepassingen.
Hierin beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en zuiveren twee subpopulaties van perivasculaire stam / progenitorcellen uit humaan foetaal of volwassen myocardium. Deze prospectieve cel isolatie methode zal onderzoekers in staat stellen om isogene perivasculaire stamcellen / voorlopercellen cel subsets van menselijk hart biopsieën voor vergelijkende studies en furthe verkrijgenr verkennen hun therapeutisch potentieel in diverse cardiale pathologische omstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Steeds meer bewijs ondersteunt een beperkte regeneratieve capaciteit van de volwassen menselijk hart na een blessure. Identificatie en karakterisatie van natief precursorcellen verantwoordelijk zijn voor dergelijke regeneratieve respons gewonde harten essentieel voor zowel het begrijpen van geassocieerde mechanismen en signaalwegen en de ontwikkeling van benaderingen van deze cellen therapeutisch gebruik.
Vorige protocollen zijn de isolatie van perivasculaire voorloper cel subsets beschreven…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children’s Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).
Materials
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film – Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
Riferimenti
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
- Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).
- Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94 (1), 92-95 (2004).
- Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81 (10), 1390-1397 (2006).
- Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21 (10), 1199-1205 (2009).
- Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15 (10), 730-738 (2008).
- Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35 (9), 1466-1475 (2007).
- Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (5), 1634-1643 (2008).
- Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).
- Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6 (3), 241-249 (2003).
- Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51 (5), 363-369 (2000).
- Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15 (4), 215-228 (2004).
- Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314 (1), 15-23 (2003).
- Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
- Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).
- Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).
- Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).
- Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).
