Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe
Summary
Menschliche Herzgewebe birgt multi perivaskuläre Vorläuferzellpopulationen, die für myokardiale Regeneration geeignet sein können. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die gleichzeitige Isolierung und Reinigung von zwei multi stromalen Zellpopulationen , die mit nativem Blutgefäße, dh CD146 + CD34 – Perizyten und CD34 + CD146 – Adventitia – Zellen aus dem menschlichen Herzmuskel.
Abstract
Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34– pericytes and vascular CD34+CD146– adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.
Introduction
Das Herz ist seit langem ein post-mitotischen Organ betrachtet worden. Allerdings haben die jüngsten Studien , die die Anwesenheit von begrenzter Kardiomyozyten Umsatz in erwachsenen menschlichen Herzen zeigten 1. Einheimische Stamm- / Vorläuferzellen mit Kardiomyozyten Differenzierungspotential haben auch im Myokard bei erwachsenen Nagetieren und die Herzen der Menschen, einschließlich Sca-1 +, c-kit +, cardiosphere bildende und zuletzt, perivaskuläre Vorläuferzellen 2,3 identifiziert worden. Diese Zellen stellen attraktive Kandidaten für Therapien zur Verbesserung der Herz Reparatur / Regeneration durch Zelltransplantation oder Stimulation der Proliferation in-situ gerichtet.
Mesenchymalen Stamm- / Stromazellen (MSC) wurden aus fast jedem menschlichen Gewebe 4,5 Klinische Studien der therapeutischen Anwendungen von MSC durchgeführt wurden für mehrere pathologische Zustände wie Herz – Kreislauf – Reparatur 6, Graft-versus-host-Krankheit 7 isoliert </sup> Und Leberzirrhose 8. Positive Effekte wurden auf die Fähigkeit von MSCs zu zugeschrieben: die Heimat von Entzündungsherden 9; Differenzierung in verschiedene Zelltypen 10; sezernieren pro-reparative Moleküle 11; und modulieren Wirtsimmunantworten 12. Die Isolierung von MSCs ist traditionell auf ihre bevorzugte Einhaltung von Kunststoffsubstraten verlassen. Jedoch ist die sich ergebende Population von Zellen typischerweise deutlich heterogenes 13. Durch die Verwendung von Fluoreszenz – aktivierte Zellsortierung (FACS) mit einer Kombination von Schlüssel perivaskuläre Zellmarker, konnten wir eine multi MSC artigen Vorläuferpopulation (CD146 + / CD31 – / CD34 – / CD45 – / CD56 -) zur Isolierung und Reinigung von mehrere menschliche Gewebe einschließlich der Erwachsenenskelettmuskulatur und weiße Fett 14.
Perivaskuläre Zellpopulationen in verschiedenen Nicht-Herzgewebe haben ein gezeigt, Stamm- / Vorläuferzelleigenschaften habennd werden für den klinischen Einsatz in der Herz-Kreislauf-Einstellung untersucht. Perizyten, einer der bekanntesten perivaskulärem Zell – Subpopulationen, sind eine heterogene Population , die 15 in der Entwicklung neuer Schiffe , darunter mehrere pathophysiologische Rolle spielen, die Regulation des Blutdrucks 16 und Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität 17,18. Wie in vielen Geweben gezeigt, spezifische Teilmengen von Perizyten nativ MSC Antigene exprimieren und ihre MSC-ähnliche Phänotypen in Primärkultur nach FACS Reinigung 14 aufrecht zu erhalten. Außerdem halten diese Zellen stabil ihre langfristigen Phänotypen in der Kultur und zeigen Multi-Linie Differenzierungspotential, ähnlich wie MSCs 19,20. Diese Ergebnisse legen nahe , dass Perizyten sind einer der Ursprünge der schwer fassbaren MSC 14. Das therapeutische Potential von Perizyten wurde mit einer Verringerung der myokardialen Vernarbung und verbesserte Herzfunktion nach der Transplantation nachgewiesen in ischämisch verletztHerzen 21. Vor kurzem haben wir Perizyten aus dem humanen Myokard erfolgreich gereinigt und zeigten ihre MSC-ähnliche Phänotypen und Multipotenz (Adipogenese, Chondrogenese und Osteogenese) mit dem Fehlen von Skelett myogenesis 3. Darüber hinaus zeigte myokardialen pericytes Differential kardiomyogenen Potential und angiogene Kapazitäten im Vergleich zu Kollegen aus anderen Organen gereinigt.
Eine zweite Population von multipotenten perivaskulären Stammzellen / Vorläuferzellen, die adventitiellen Zelle, hat sich von menschlichen Saphenavenen auf der Grundlage der positiven CD34 – Expression 22 isoliert. Venöse adventitiellen Zellen wurden clonogene Potenzial, mesodermalen Differenzierungsfähigkeit und proangiogenic Potential in vitro haben gezeigt. Transplantation dieser Zellen in die ischämisch verletzten Herzen von Mäusen führte zu einer Verringerung der interstitiellen Fibrose, einer Zunahme der Angiogenese und myokardiale Blutfluß reduziert ventrikulären dilation und erhöhte Herzauswurffraktion 23. Interessanterweise haben adipöse adventitiellen Zellen wurden mit Stimulation 24 gezeigt CD34 – Expression verlieren und upregulate CD146 – Expression in Kultur als Reaktion auf Angiopoietin II Behandlung, was auf die Annahme eines pericyte Phänotyp. Innerhalb des Herzens, jedoch hat die Adventitia-Zellpopulation noch nicht durch FACS und / oder gut charakterisiert prospektiv gereinigt. Unter Verwendung der Zellisolierungsverfahren in den folgenden Abschnitten beschrieben, charakterisieren wir derzeit myokardialen adventitiellen Zellen und untersuchen ihr Potential für die regenerative Anwendungen.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zwei Subpopulationen von perivaskulären Stamm- / Vorläuferzellen aus menschlichen fötalen oder erwachsenen Myokard zu isolieren und zu reinigen. Diese prospektive Zellisolierungsverfahren ermöglichen es den Forschern zu isogenen perivaskulären Stammzellen / Vorläuferzelluntergruppen aus menschlichem Herz-Biopsien für vergleichende Studien und furthe erhaltenr erkunden ihr therapeutisches Potential in verschiedenen Herz pathologischen Zuständen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zunehmende Beweise unterstützt eine begrenzte Regenerationsfähigkeit des erwachsenen menschlichen Herzens nach einer Verletzung. Identifizierung und Charakterisierung von nativen Vorläuferzellen verantwortlich für solche regenerative Reaktionen in verletzten Herzen sind beide entscheidend für das Verständnis der damit verbundenen Mechanismen und Signalwege und die Entwicklung von Ansätzen, diese Zellen therapeutisch zu nutzen.
Vorherige Protokolle haben die Isolierung von perivaskulä…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children’s Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).
Materials
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film – Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
Riferimenti
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
- Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).
- Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94 (1), 92-95 (2004).
- Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81 (10), 1390-1397 (2006).
- Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21 (10), 1199-1205 (2009).
- Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15 (10), 730-738 (2008).
- Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35 (9), 1466-1475 (2007).
- Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (5), 1634-1643 (2008).
- Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).
- Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6 (3), 241-249 (2003).
- Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51 (5), 363-369 (2000).
- Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15 (4), 215-228 (2004).
- Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314 (1), 15-23 (2003).
- Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
- Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).
- Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).
- Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).
- Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).
