मानव हृदय के ऊतकों से Perivascular multipotent अग्रदूत सेल आबादी के अलगाव
Summary
मानव हृदय के ऊतकों multipotent परिवाहकीय अग्रदूत सेल आबादी है कि दौरे के उत्थान के लिए उपयुक्त हो सकता है बंदरगाहों। Pericytes और CD34 + CD146 – – adventitial कोशिकाओं, मानव मायोकार्डियम से तकनीक यहाँ वर्णित एक साथ अलगाव और दो multipotent stromal सेल मूल निवासी रक्त वाहिकाओं, यानी CD146 + CD34 के साथ जुड़े आबादी की शुद्धि के लिए अनुमति देता है।
Abstract
Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34– pericytes and vascular CD34+CD146– adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.
Introduction
दिल लंबे समय से एक बाद mitotic अंग माना गया है। हालांकि, हाल के अध्ययनों से वयस्क मानव मन 1 में सीमित cardiomyocyte कारोबार की उपस्थिति का प्रदर्शन किया है। Cardiomyocyte भेदभाव क्षमता के साथ मूल निवासी स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं को भी परिवाहकीय अग्रदूत साबित कोशिकाओं 2,3 वयस्क कृंतक और मानव मन, सहित Sca -1 +, सी-किट +, cardiosphere के गठन में मायोकार्डियम में पहचाना गया है, और सबसे हाल ही में,। इन कोशिकाओं को सेल प्रत्यारोपण या में सीटू प्रसार की उत्तेजना के माध्यम से हृदय की मरम्मत / उत्थान बढ़ाने के उद्देश्य से उपचार के लिए आकर्षक उम्मीदवारों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
Mesenchymal स्टेम / stromal कोशिकाओं (एमएससी) इस तरह के हृदय की मरम्मत 6 के रूप में लगभग हर मानव ऊतक 4,5 एमएससी की चिकित्सीय अनुप्रयोगों के नैदानिक परीक्षणों कई रोग की स्थिति के लिए बाहर किया गया है से पृथक किया गया है, भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग 7 </sup>, और लीवर सिरोसिस 8। लाभदायक प्रभाव के लिए MSCS की क्षमता के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है: सूजन 9 की साइटों के लिए घर; विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में अंतर 10; समर्थक विरोहक अणुओं 11 छिपाना; और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 12 मिलाना। MSCs के अलगाव के पारंपरिक रूप से प्लास्टिक substrates के लिए उनकी तरजीही पालन पर भरोसा किया है। हालांकि, कोशिकाओं के परिणामस्वरूप जनसंख्या आम तौर पर स्पष्ट रूप से heterogenous 13 है। से फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल कुंजी परिवाहकीय सेल मार्कर के संयोजन के साथ छँटाई (FACS) का उपयोग करके, हम अलग और एक multipotent एमएससी की तरह अग्रदूत आबादी (- / CD34 – / CD45 – – / CD56 CD146 + / CD31) को शुद्ध करने के लिए सक्षम किया गया है वयस्क कंकाल की मांसपेशी और सफेद वसा 14 सहित कई मानव ऊतकों।
विभिन्न गैर-हृदय के ऊतकों में Perivascular सेल आबादी स्टेम / पूर्वज सेल गुण एक है दिखाया गया हैएन डी हृदय में स्थापित करने में नैदानिक इस्तेमाल के लिए जांच की जा रही है। Pericytes, सबसे अच्छी तरह से जाना जाता है perivascular सेल सबसेट में से एक, एक विषम आबादी है कि नए जहाजों 15 के विकास में सहित कई pathophysiological भूमिका निभाते हैं, रक्तचाप 16, और संवहनी अखंडता 17,18 के रखरखाव के विनियमन। के रूप में कई ऊतकों में दिखाया गया है, pericytes के विशिष्ट सबसेट natively एमएससी एंटीजन व्यक्त करने और FACS शुद्धि 14 के बाद प्राथमिक संस्कृति में अपनी एमएससी की तरह phenotypes बनाए। इसके अलावा, इन कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक संस्कृति के भीतर उनके दीर्घकालिक phenotypes को बनाए रखने और बहु-वंश भेदभाव क्षमता, MSCs 19,20 के समान दिखा रहे हैं। इन परिणामों का सुझाव है कि pericytes मायावी एमएससी 14 के मूल में से एक हैं। pericytes की चिकित्सीय क्षमता दौरे scarring में कमी के साथ प्रदर्शन किया और प्रत्यारोपण के बाद हृदय समारोह बढ़ाया में ischemically घायल हो गया हैदिलों को 21। हाल ही में, हम सफलतापूर्वक मानव मायोकार्डियम से pericytes शुद्ध और कंकाल myogenesis 3 के अभाव के साथ अपनी एमएससी की तरह phenotypes और multipotency (वसाजनन, उपास्थिजनन और osteogenesis) का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, मायोकार्डियल pericytes जब अन्य अंगों से शुद्ध समकक्षों के साथ तुलना में अंतर cardiomyogenic क्षमता और एन्जियोजेनिक क्षमता का प्रदर्शन किया।
Multipotent perivascular स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं, adventitial सेल का एक दूसरा आबादी, सकारात्मक CD34 अभिव्यक्ति 22 के आधार पर मानव saphenous नसों से अलग-थलग कर दिया गया है। शिरापरक adventitial कोशिकाओं clonogenic क्षमता, mesodermal भेदभाव क्षमता और इन विट्रो में proangiogenic संभावित है दिखाया गया है। चूहों के ischemically घायल दिलों में इन कोशिकाओं के प्रत्यारोपण मध्य फाइब्रोसिस में कमी, angiogenesis और मायोकार्डियल रक्त के प्रवाह में वृद्धि, कम वेंट्रिकुलर दिल में हुईसमझना, और वृद्धि की हृदय इंजेक्शन फ्रैक्शन 23। दिलचस्प है, वसा कोशिकाओं adventitial CD34 अभिव्यक्ति खो और angiopoietin द्वितीय उपचार के जवाब में संस्कृति में CD146 अभिव्यक्ति upregulate, उत्तेजना 24 के साथ एक pericyte phenotype के गोद लेने का सुझाव करने के लिए दिखाया गया है। दिल के भीतर, तथापि, adventitial सेल की आबादी नहीं अभी तक भावी FACS और / या अच्छी तरह से होती द्वारा शुद्ध किया गया है। सेल अलगाव प्रक्रियाओं का पालन वर्गों में वर्णित का उपयोग, हम वर्तमान दौरे adventitial कोशिकाओं निस्र्पक और पुनर्योजी अनुप्रयोगों के लिए अपनी क्षमता की जांच कर रहे हैं।
इस के साथ साथ हम अलग और मानव भ्रूण या वयस्क मायोकार्डियम से perivascular स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं के दो उप-जनसंख्या को शुद्ध करने के लिए एक विधि का वर्णन। इस संभावित सेल अलगाव विधि शोधकर्ताओं तुलनात्मक अध्ययन और furthe के लिए मानव हृदय बायोप्सी से isogenic perivascular स्टेम / पूर्वज सेल सबसेट प्राप्त करने के लिए सक्षम हो जाएगाआर विभिन्न हृदय रोग की स्थिति में उनके चिकित्सीय क्षमता का पता लगाने।
Protocol
Representative Results
Discussion
बढ़ती सबूत चोट के बाद वयस्क मानव हृदय के एक सीमित पुनर्योजी क्षमता का समर्थन करता है। पहचान और घायल दिलों में इस तरह के पुनर्योजी प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार मूल निवासी अग्रदूत साबित कोशिकाओं के लक्…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children’s Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).
Materials
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film – Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
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