인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리
Summary
인간의 심장 조직 심근 재생에 적합 할 수있는 다 능성 혈관 주위 전구체 세포 집단을 항구. 주연 세포와 CD34 + CD146 – – 외막 세포, 인간 심근에서 여기에 설명 된 기술은 원시 혈관, 즉 CD34 + CD146와 연관된 두 능성 간질 세포 집단의 동시 분리 및 정제를 허용한다.
Abstract
Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34– pericytes and vascular CD34+CD146– adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.
Introduction
마음은 긴 후 유사 분열 기관으로 간주되고있다. 그러나 최근의 연구는 성인 인간의 마음 (1) 제한 심근 매출의 존재를 증명하고있다. 심근 분화 가능성을 가진 기본 줄기 / 전구 세포는 혈관 주위 전구 세포 2, 3, 가장 최근에 성인 설치류와 무서-1 +를 포함하여 인간의 마음, C-키트 +, cardiosphere 형성의 심근 내에서 확인할하고있다. 이러한 세포는 세포 이식 또는 원위치 증식 자극으로 심장 수선 / 재생을 향상시키는 목적으로 치료를위한 매력적인 후보를 나타낸다.
중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)가 심혈관 수리 6으로 MSC의 치료 응용 4,5- 임상 시험은 여러 병리학 적 조건에서 수행 된 거의 모든 인간의 조직으로부터 분리 된, 이식편 대 숙주 질병 7 </sup> 및 간경변 8. 유익한 효과에 중간 엽 줄기 세포의 능력에 기인 한 : 염증 9의 사이트에 홈; 상이한 세포 유형으로 분화 10; 프로 수복 분자 (11)을 분비; 호스트 면역 반응 (12)을 변조한다. 중간 엽 줄기 세포의 분리는 전통적으로 플라스틱 기판에 자신의 우선 준수에 의존하고있다. 그러나, 세포의 생성은 일반적 인구 13 현저 균질하다. 에서 주요 혈관 주위 세포 마커의 조합 (FACS)을 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여, 우리는 다 능성 MSC와 같은 전구체 인구 (- / CD34 – / CD45 – – / CD56 CD146 + / CD31)를 분리하고 정제 할 수 있었다 성인 골격 근육과 흰색 지방 (14) 등 다양한 인체 조직.
다양한 비 심장 조직에서 혈관 주위 세포 집단은 줄기 / 전구 세포의 특성있는 것으로 나타났다차 심장 혈관 설정에서 임상 적 사용을 위해 연구되고있다. 주위 세포, 가장 잘 알려진 혈관 주위 세포의 서브 세트 중 하나가 새로운 용기 (15)의 개발을 포함하여 여러 병태 생리 학적 역할을 이종 집단이며, 혈압 (16), 및 혈관 완전성 (17, 18)의 유지의 조절. 여러 조직에 도시 된 바와 같이, 혈관 주위 세포의 특정 서브 세트는 기본적 MSC 항원을 발현하고 FACS 정제 후 14 주 배양에서의 MSC와 같은 표현형을 유지. 또한, 이들 세포는 안정하게 배양 내에서의 장기 표현형을 유지하고, MSC들 (19, 20)과 유사한 다중 – 계통 분화 잠재력을 나타낸다. 이러한 결과는 혈관 주위 세포가 어려운 MSC (14)의 기원 중 하나입니다 것이 좋습니다. 혈관 주위 세포의 치료 가능성은 심근 흉터의 감소와 함께 시연 및 ischemically 부상으로 이식 다음 심장 기능을 향상되었습니다마음 21. 최근에, 우리는 성공적으로 인간의 심근에서 혈관 주위 세포를 정제 및 골격 근육 생성 3의 부재로 자신의 MSC와 같은 표현형과 다 능성 (지방 조직, 연골 및 골 형성)을 보여 주었다. 또한, 심근 혈관 주위 세포는 다른 기관으로부터 정제 대조와 비교하여 차등 cardiomyogenic 전위 및 혈관 신생 능력을 나타냈다.
혈관 주위 능성 줄기 / 선조 세포의 세포 외막의 제 인구 양성 CD34 식 (22)에 기초하여 인간 복재 정맥으로부터 분리되었다. 정맥 외막 세포 클론 원성 포텐셜 중배엽 분화 능력 및 체외 proangiogenic 가능성이있는 것으로 밝혀졌다. 마우스의 ischemically 부상 마음에서 이러한 세포 이식 간질 성 섬유증의 감소, 혈관과 심근 혈류의 증가, 감소, 심실 DIL 초래ATION, 증가 된 심장 배출 분율 23. 흥미롭게도, 지방 외막 세포를 자극 (24)와 주연 세포 표현형의 채택을 제안, CD34의 발현을 잃고 안지 오포 이에 틴 II 치료에 대한 반응에 문화에서 CD146 발현을 상향 조절하는 것으로 나타났다. 심장 내에서, 그러나, 외막 세포 집단은 아직 전향 FACS 및 / 또는 잘 특징으로 정제되지 않았다. 다음 절에 설명 된 세포 격리 절차를 활용하여, 우리는 현재 심근 외막 세포의 특성 및 재생 응용 프로그램에 대한 자신의 가능성을 조사하고있다.
여기서 우리는 분리하고 인간의 태아 또는 성인 심근의 혈관 주위 줄기 / 전구 세포의 두 개체군을 정화하는 방법을 설명합니다. 이 미래의 세포 분리 방법을 비교 연구하고 furthe에 대한 인간의 마음 생검에서 동종 혈관 주위 줄기 / 전구 세포 하위 집합을 얻기 위해 연구를 가능하게 할 것이다R 다양한 심장의 병리 적 상태에서의 치료 가능성을 탐구한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
증가 증거는 부상 후 성인 인간의 마음의 제한된 재생 능력을 지원합니다. 부상 마음에 이러한 재생 반응에 대한 책임 네이티브 전구 세포의 식별 및 특성화 관련 메커니즘 및 신호 전달 경로의 이해와 치료 이러한 세포를 활용하는 방법의 개발 모두에 중요하다.
이전 프로토콜 인간 골격근 (25)로부터 혈관 주위 전구 세포 서브 세트의 분리를 설명 하였다. 그러나, 심…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children’s Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).
Materials
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film – Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
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