الجمع بين الفحص المجهري نيون إينترافيتال (إيففم) مع النماذج الوراثية لدراسة ديناميات Engraftment الخلايا المكونة للدم لمنافذ نخاع العظام
Summary
يتم تطبيق مجهرية الأسفار إينترافيتال (إيففم) كالفاريوم في تركيبة مع الوراثية نماذج حيوانية لدراسة صاروخ موجه وانجرافتمينت من الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم (بي أم) منافذ.
Abstract
أدلة متزايدة تشير إلى أن هيماتوبويسيس طبيعية وينظم العظة ميكرونفيرونمينتال متميزة في بي أم، التي تشمل منافذ الخلوية المتخصصة تحوير الوظائف الحيوية من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC)1،2. وفي الواقع، صورة أكثر تفصيلاً عن المكروية المكونة للدم يظهر الآن، التي تشكل بطانة العظم وعلى منافذ غشائي الوحدات الوظيفية لتنظيم HSC العادي وعلى ذرية3،4،5 . وأظهرت الدراسات الجديدة أهمية ارتشاح الخلايا، adipocytes والخلايا العصبية في الحفاظ على وتنظم HSC الدالة6،،من78. وعلاوة على ذلك، هناك أدلة على أن الخلايا من الأنساب المختلفة، أي من الخلايا النقوي واللمفاوية، والمنزل، ويقيمون في منافذ محددة داخل المكروية BM. تعيين كامل المكروية BM وركابها غير قيد التقدم.
السلالات المحورة وراثيا الماوس يعبر عن النسب المحددة علامات مضيئة أو الفئران المهندسة وراثيا إلى الافتقار إلى جزيئات المحدد في خلايا معينة من مكانة BM متوفرة الآن. المغلوب والنسب تتبع النماذج، في تركيبة مع النهج زرع الأعضاء، وتوفير الفرصة لصقل المعارف بشأن دور محدد “المتخصصة” الخلايا لتعريف السكان المكونة للدم، مثل HSC، ب-الخلايا، خلايا تي، الخلايا النقوي و خلايا محمر. يمكن أن تكون هذه الاستراتيجية potentiated كذلك بدمج استخدام اثنين-فوتون الفحص المجهري كالفاريوم. بتوفير في فيفو تصوير عالية الدقة والتقديم ثلاثية الأبعاد من كالفاريوم بي أم، ونحن الآن تحديد دقة موقع حيث الرئيسية في بي أم في المجموعات الفرعية المكونة للدم محددة وتقييم حركية توسعها على مر الزمن. هنا، يتم استخدام ليز-بروتينات فلورية خضراء الفئران المحورة وراثيا (تمييز الخلايا النقوي)9 ورببج الفئران المغلوب (ينقصها الإشارات الشق الكنسي)10 في تركيبة مع إيففم لتحديد engraftment الخلايا النقوي إلى المكروية BM معيبة درجة.
Introduction
مجهر الأسفار مولتيفوتون إينترافيتال (إيففم) هو تقنية تصوير قوية تسمح لعاليه الدقة في الوقت الحقيقي، والتصوير من الأنسجة بعمق يصل إلى 1 مم، اعتماداً على الأنسجة. عندما يطبق على كالفاريوم الماوس، يسمح بمراقبة سلوك الخلايا المكونة للدم داخل BM بطريقة غير الغازية يصل إلى 60-100 ميكرومتر11. يتم استخدام هذا النهج هنا لتحديد حركية engraftment المتكفل النقوي العادي في الفئران المغلوب BM رببج تفتقر إلى إشارات الشق الكنسي.
العمل مؤخرا من مجموعتنا أثبتت أن عيب المتعارف عليه الشق إشارات يؤدي المكروية BM ل مرض مثل ميلوبروليفيراتيفي12. حصل فقدان الإشارات الشق شرطية حذف مجال رببج، عامل النسخ الحرجة المصب الشق الكنسي يشير، باستخدام Mx1-لجنة المساواة العرقية التي يسببها جزئ10ربط الحمض النووي. في هذه الدراسة، استخدم نموذج الفئرانلوكس/لوكس Mx1-Cre/رببج. يؤدي حذف الشرطي لفكرة ربط الحمض النووي من رببج فقدان الإشارات من جميع حز المستقبلات. في طراز Mx1-لجنة المساواة العرقية، لجنة المساواة العرقية التعبير محكوم بالمروج Mx1 المنشط لدى إدارة polyI:C أدى إلى تنظيم دورات تعريفية لحذف الجينات المستهدفة في خلايا الدم فضلا عن مكونات stromal من أجهزة متعددة، بما في ذلك بي أم والطحال والكبد.
Mx1-لجنة المساواة العرقية+/RBPJلوكس/لوكس و Mx1-لجنة المساواة العرقية–/RBPJلوكس/لوكس الفئران التي يسببها مع polyI:C (الممتلكات المشار إليها بوصفها رببجكو ورببجوت، على التوالي) دكت المشع وزرع الخلايا المكونة للدم نوع البرية العادية،. ابتداء من الأسبوع الرابع بعد زرع الأعضاء، وضع رببجكو المستلمين كبير الكريات متبوعاً بتضخم الطحال. على الرغم من أن عرضت الفئران رببجكو زيادة النسبة المئوية لموروث النقوي في بي أم في الأسبوع 8 بعد زرع وفي نقاط زمنية لاحقة، تحليل BM في الأسابيع 4 و 6 لم تكشف عن اختلافات ملفتة للنظر في مضمونها النقوي الخلية مقارنة بالتحكم رببجوت المستلمين. هذه الملاحظة، جنبا إلى جنب مع حقيقة أن هو أعرب عن Mx1-لجنة المساواة العرقية في مختلف الهيئات المكونة للدم، إلى التساؤل عما إذا كان المكروية BM أثر مباشر على الشروع في النمط الظاهري ميلوبروليفيراتيفي.
تحديد ما إذا كان BM موقع أولى حاسمة لتطوير المرض، استخدمت إيففم كالفاريوم الماوس في تركيبة مع بي أم زرع (BMT)، ونموذج المغلوب رببج، ونسب تتبع النظام. الفئران المعدلة وراثيا معربا عن اجفب تحت سيطرة المروج (Lys-التجارة والنقل) lysozyme محددة9 استخدمت للحصول على خلايا المانحين التي يمكن تصور خلال BM التصوير بعد BMT. التعبير lysozyme محددة للخلايا النقوي و Lys-التجارة والنقل يمثل خلايا من السلف النقوي المشتركة (CMP) المحببات ناضجة13.
إيففم BM في نقاط زمنية مختلفة أظهرت أن الخلايا Lys-التجارة والنقل المخزن وبالمثل إلى المستلمين BM رببجوت ورببجكو، لكن توسع وانجرافتيد أسرع في المستلمين BM رببجكو. هذه الفرق كانت مثيرة في النقطة الزمنية السابقة (الأسبوع الثاني) وانخفض مع مرور الوقت (أيام 4 و 6). ومع ذلك، عند هذه النقاط وقت لاحق، التقييم المقصورة المكونة للدم في نفس المتلقي أظهرت زيادة مطردة في عدد الخلايا النقوي المتداولة في الجريدة الرسمية والمترجمة في طحال الفئران رببجكو، مما يدل زيادة ناتج من الخلايا من BM في الدورة الدموية. كشف تحليل للتعريب الخلايا Lys-التجارة والنقل في بي أم فئران زرع في 6 أسابيع أن الخلايا النقوي كانوا يقيمون أبعد عن المفرج في المكروية رببجكو مما في عنصر التحكم.
جماعياً، مزيج إيففم مع هذه النماذج الحيوانية محددة قدمت أفكاراً في ديناميات الخلايا النقوي في المكروية BM رببجكو engraftment. التصميم التجريبي والنهج الكمي الموصوفة هنا يقترح نموذجا يمكن تطبيقه لمعالجة مسائل مماثلة. على سبيل المثال، قد يسمح استخدام النسب المحددة خلية أخرى تتبع النماذج، مثل التجارة والنقل RAG114 أو15 Gata1-بروتينات فلورية خضراء الفئران، في أعقاب سلوك اللمفاوية أو فروعه محمر، على التوالي، في بي أم.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول تصميم تجريبي الأمثل لدراسة حركية engraftment الخلايا المكونة للدم “الفحص المجهري الفلورسنت إينترافيتال”. في هذه الدراسة، كان توسيع نطاق الخلايا السلف النقوي في BM WT أو في الشق إشارات BM المعيبة تعقبها في كالفاريوم العظام التالية Lys-بروتينات فلورية خضراء إيجابية النقوي الخلاي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أجرى تصوير في مركز إنديانا “الميكروسكوب البيولوجي” في جامعة إنديانا، الموجهة من قبل الدكتور كين دن. جهاز ستيريوتاكسيك نموذج تصميم ومارك سونبا، آبار مركز بحوث “طب الأطفال”. وأيد هذا العمل بالمعاهد الوطنية للصحة/R01DK097837-09 (نورث كارولاينا)، والمعاهد الوطنية للصحة/R01HL068256-05 (NC)، والمعاهد الوطنية للصحة/NIDDK1U54DK106846-01 (NC)، البحوث MPN مؤسسة (NC) و “التعاونية كتسي” مشروع كلية/Notre Dame (NC).
Materials
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2X2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28g, 1/2cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
Riferimenti
- Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
- Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
- Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
- Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
- Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
- Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
- Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
- Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683 (2014).
