La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo

Sommario

Microscopia di fluorescenza intravital (IVFM) del calvarium è applicata in combinazione con i modelli genetici animali per studiare l'homing e l'attecchimento di cellule ematopoietiche in nicchie del midollo osseo (BM).

Abstract

La prova aumentante indica che ematopoiesi normale è regolata da stimoli microambientali distinti in BM, sono specializzati nicchie cellulare modulazione critica di cellule staminali ematopoietiche (HSC) funzioni^1,2. Infatti, un quadro più dettagliato del microambiente ematopoietico ora sta emergendo, in cui l'endostali e le nicchie endoteliali formano unità funzionali per la regolazione del normale HSC e loro progenie^3,4,5 . Nuovi studi hanno rivelato l'importanza delle cellule perivascolari, adipociti e cellule neuronali nel mantenimento e regolamentare HSC funzione^6,7,8. Inoltre, c'è prova che le cellule da stirpi differenti, vale a dire le cellule mieloidi e linfoidi, casa e risiede in nicchie specifiche all'interno del microambiente di BM. Tuttavia, una mappatura completa del microambiente BM e dei suoi occupanti è ancora in corso.

Diversi ceppi di topi transgenici che esprimono marcatori fluorescenti specifico lignaggio o topi geneticamente per mancanza di molecole selezionate in specifiche cellule della nicchia BM sono ora disponibili. Knock-out e lignaggio rilevamento modelli, in combinazione con approcci di trapianto, offrono la possibilità di perfezionare le conoscenze sul ruolo di specifici "di nicchia" cellule per popolazioni ematopoietiche definite, ad esempio HSC, B-cellule, cellule T, cellule mieloidi e cellule eritroidi. Questa strategia può essere ulteriormente rafforzata unendo l'uso di microscopia del due-fotone del calvarium. Fornendo in vivo imaging ad alta risoluzione e rendering 3D del calvarium BM, possiamo ora determinare precisamente la posizione dove specifici sottoinsiemi ematopoietiche home in BM e valutare la cinetica della loro espansione nel corso del tempo. Qui, Lys-GFP topi transgenici (marcatura cellule mieloidi)⁹ e RBPJ topi knock-out (carente canonico tacca di segnalazione)¹⁰ sono utilizzati in combinazione con IVFM per determinare l'attecchimento di cellule mieloidi ad un microambiente BM difettoso di tacca.

Introduzione

Microscopia di fluorescenza multifotonica videomicroscopia (IVFM) è una potente tecnica di imaging che permette ad alta risoluzione, in tempo reale immagini di tessuti con profondità fino a 1mm, a seconda del tessuto. Quando applicato al calvarium del mouse, permette di osservare il comportamento delle cellule ematopoietiche all'interno il BM in maniera non invasiva fino a 60-100 μm¹¹. Questo approccio è usato qui per determinare la cinetica di attecchimento dei progenitori mieloidi normali nei topi knock-out BM di RBPJ carente canonico tacca di segnalazione.

Recenti lavori del nostro gruppo ha dimostrato quello dife....

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono l'uso di animali sono state effettuate con l'autorizzazione della cura degli animali e utilizzare Comitato di Indiana University School of Medicine. Assicurarsi di rispettare la legislazione sulla sperimentazione animale del paese dove il lavoro viene eseguito.

1. preparazione del Mx1CreRBPJ^{- / -} Mice destinatario

1. Cross Mx1-Cre⁺ topi con RBPJ^lox/lox topi¹⁰ per ottenere Mx1-Crepositivo ^RBPJlox/lox topi¹² e Mx1-Cre negative littermates^lox/lox RBPJ da utilizzare come controlli. ....

Risultati

Coorti di 2 RBPJKO e 2 RBPJWT destinatari erano imaged in una singola sessione di imaging in diversi momenti: 24 h e 2, 4 e 6 settimane dopo il trapianto di cellule BM Lys-GFP (flusso di lavoro è illustrato in Figura 1A).

In ogni mouse, le immagini sono state acquisite da 6 regioni standard del calvarium BM, identificati dalla loro posizione in relazione alla biforcazione della vena centrale (Figura 2A

Discussione

Questo protocollo descrive un disegno sperimentale ottimizzato per studiare la cinetica di attecchimento di cellule ematopoietiche da microscopia di fluorescenza Intravital. In questo studio, l'espansione di cellule progenitrici mieloidi in un BM WT o in una tacca di segnalazione difettosa BM è stato registrato in calvarium osseo dalle cellule mieloidi positive di Lys-GFP seguente dopo BMT in destinatari RBPJWT o RBPJKO. Questo approccio è proposto come un modello che può essere applicato per affrontare simili questioni,.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cocktail di ketamina	IU School of Medicine		Ketamina 90-100 mg/kg, Xilazina 2,5-5,0 mg/kg, Acepromazina 1,0-2,5 mg/kg
TRITC destrano	Tdb Consultancy	TD150-100mg	Può essere utilizzato destrano di altri colori.
Andis tagliacapelli	Braintree Scientific	CLP-323 75
Spugna di garza	Med Vet International	PK224	4 strati, 2 x 2
Nair crema depilatoria	Negozio
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0,9% Cloruro di sodio poli-flacone
Siringa da insulina	Fisher Scientific	14-826-79	28 g, 1/2 cc
Pinze fini	Strumenti per le scienze	00108-11, 00109-11	pinza diritta, pinza angolata
Forbice	Strumenti per le scienze Fini 15018-10
Porta aghi	scienze fini 12002-14
5-0 sutura in seta	Fisher Scientific	MV-682	È possibile utilizzare altre suture non assorbibili
WillCo- piatto con fondo in vetro	WillCo	GWSt-5040
Olio per microscopio ottico	Leica
Inserto stereotassico	IU School of Medicine	Design
Sistema di microscopio confocale Olympus FV1000	Obiettivo Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95	Olympus
Piccolo termoforo	Negozio		Zoo Med termoforo per rettili
Software di imaging Imaris 8.1	Bitplane		3/4 D Software di visualizzazione e analisi delle immagini

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