Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

Summary

Microscopía de fluorescencia intravital (IVFM) de la bóveda craneal se aplica en combinación con la genéticos modelos animales para estudiar el autoguiado hacia el blanco y el engraftment de células hematopoyéticas en la médula (BM) nichos.

Abstract

Creciente evidencia indica que la hematopoyesis normal está regulada por distintas señales microambiental en el BM, que incluyen nichos celulares especializadas modulación crítica de células madre hematopoyéticas (HSC) funciones^1,2. De hecho, un cuadro más detallado del microambiente hematopoyético ahora surge, en el cual los endoóseos y los nichos endoteliales forman unidades funcionales para la regulación de HSC normal y su progenie^3,4,5 . Nuevos estudios han revelado la importancia de las células perivasculares, adipocitos y células neuronales en el mantenimiento y regulación de la función HSC^6,7,8. Además, hay evidencias de que células de diferentes linajes, es decir, las células mieloides y linfoides, hogar y residen en nichos específicos dentro del microambiente de BM. Sin embargo, una asignación completa del microambiente del BM y de sus ocupantes aún está en progreso.

Cepas de ratón transgénico que expresan marcadores fluorescentes específicos de linaje o ratones genéticamente modificados para carecer de las moléculas en células específicas del nicho BM están ahora disponibles. Knock-out y linaje seguimiento de modelos, en combinación con métodos de trasplante, proporcionan la oportunidad de perfeccionar el conocimiento sobre el papel de específicas “niche” células para poblaciones hematopoyéticas definidas como HSC, de células B, células T, células mieloides y células eritroides. Esta estrategia puede ser potenciada aún más combinando el uso de la microscopía de dos fotones de la bóveda craneal. Proporcionando en vivo imágenes de alta resolución y 3D Render de la bóveda de BM, ahora podemos determinar precisamente el lugar donde subconjuntos hematopoyéticos específicos Inicio en el BM y evaluar la cinética de su expansión en el tiempo. Aquí, Lys-GFP ratones transgénicos (marcando las células mieloides)⁹ y RBPJ ratones knock-out (falta de señalización de Notch canónica)¹⁰ se utilizan en combinación con IVFM determinar el engraftment de células mieloides en un microambiente de BM defectuoso de muesca.

Introduction

La microscopia intravital de fluorescencia multifotón (IVFM) es una técnica de imagen de gran alcance que permite la alta resolución y en tiempo real la proyección de imagen de tejidos con profundidad hasta 1mm, dependiendo del tejido. Cuando se aplica a la bóveda del ratón, permite observar el comportamiento de las células hematopoyéticas en el BM en una manera no invasiva hasta 60-100 μm¹¹. Aquí se utiliza este enfoque para determinar la cinética del engraftment de progenitores mieloides normales en los ratones knock-out de BM de RBPJ falta de señalización de Notch canónica.

Trabajos recientes de nuestro grupo demostraron defectuosa señalización canónica de muesca en el BM microambiente conduce a una Enfermedad mieloproliferativa como¹². Pérdida de la señalización de Notch se obtuvo por supresión condicional del dominio de unión de ADN de RBPJ, el factor de transcripción crítico aguas abajo de la muesca canónica de señalización, utilizando Mx1-Cre inducida por recombinación¹⁰. En este estudio, se utilizó el modelo de ratones de Mx1-Cre/RBPJ^lox/lox . Supresión condicional adorno DNA-obligatorio del RBPJ de resultados en la pérdida de la señalización de los receptores Notch. En el modelo Mx1-Cre Cre expresión es conducida por el promotor de Mx1 activado tras la administración de polyI:C dando por resultado la inducción específica de canceladura del gene en células de la sangre así como en componentes stromal de múltiples órganos, incluyendo el BM, el bazo y el hígado.

MX1-Cre⁺/RBPJ^lox/lox y Mx1-Cre^–/RBPJ^lox/lox ratones inducidos con polyI:C (aquí en adelante denominadas RBPJKO y RBPJWT, respectivamente) fueron irradiados letalmente y trasplantados con las células hematopoyéticas normales, tipo salvaje. A partir de la 4 semana después del trasplante, los receptores RBPJKO desarrollaron leucocitosis significativa seguido por esplenomegalia. Aunque ratones RBPJKO presentaron mayor porcentaje de progenitores mieloides en el BM en la semana 8 después del trasplante y en momentos más adelante, el análisis de BM en las semanas 4 y 6 no reveló diferencias llamativas en su contenido de células mieloides en comparación con el control RBPJWT destinatarios. Esta observación, junto con el hecho de que Cre Mx1 se expresa en diferentes órganos hematopoyéticos, planteó la cuestión de si el microambiente del BM tuvo impacto directo en la iniciación del fenotipo mieloproliferativo.

Para determinar si el BM era un sitio crítico inicial de desarrollo de la enfermedad, IVFM de la bóveda de ratón se usa en combinación con BM trasplante el modelo knock-out RBPJ y un sistema de seguimiento de linaje. Ratones transgénicos que expresaban EGFP bajo el control del promotor (Lys-GFP) lisozima específico⁹ fueron utilizados para obtener células de un donante que podrían visualizarse durante BM imagen después de BMT. Expresión de lisozima es específica de las células mieloides y Lys-GFP marca células del progenitor mieloide común (CMP) para los granulocitos maduros¹³.

IVFM del BM en diferentes puntos temporales demostró que las células GFP Lys alojados de manera similar a los destinatarios BM de RBPJWT y RBPJKO, pero ampliaron y engrafted rápidamente en los receptores de la BM de RBPJKO. Esta diferencia fue dramática en el momento anterior (semana 2) y disminuye con el tiempo (semanas 4 y 6). Sin embargo, en estos momentos más adelante, evaluación del compartimiento hematopoyético en el mismo recipiente demostró un aumento constante del número de células mieloides circulantes en la PB y localizados en el bazo de los ratones RBPJKO, lo que indica un aumento de la producción de células del BM en la circulación. Análisis de localización de células Lys-GFP en el BM de ratones trasplantados a las 6 semanas reveló que las células mieloides residían más lejos de la vasculatura en el microambiente de la RBPJKO que en el control.

Colectivamente, la combinación de IVFM con estos modelos animales específicos proporciona penetraciones en la dinámica del engraftment de células mieloides en el microambiente RBPJKO BM. El diseño experimental y el enfoque cuantitativo que se descrito aquí se propone como un paradigma que puede ser aplicado para hacer frente a preguntas similares. Por ejemplo, puede permitir el uso de otro linaje específico celular seguimiento de modelos, tales como GFP RAG1¹⁴ o Gata1-GFP¹⁵ ratones, siguiendo el comportamiento de linfoide o progenitores eritroides, respectivamente, en el BM.

Protocol

Se realizaron todos los procedimientos que implican el uso de animales con autorización de cuidado Animal y Use Comité de Indiana University School of Medicine. Asegurar que se adhieran a la legislación sobre experimentación animal del país donde se realiza el trabajo. 1. preparación de Mx1CreRBPJ- / – ratones receptores Cruzar ratones RBPJlox/lox ratones10 para obtener Cre Mx1 Mx1-Cre+ positivo RBPJ…

Representative Results

Cohortes de 2 RBPJKO y 2 RBPJWT beneficiarios se reflejada en una sesión de imágenes individual en diferentes puntos temporales: 24 h y 2, 4 y 6 semanas después del trasplante de las células del BM Lys-GFP (flujo de trabajo se ilustra en la figura 1A). En cada ratón, se adquirieron imágenes de 6 regiones estándar de la bóveda de la BM, identificados por su posición en relación con la bifurcación de la…

Discussion

Este protocolo describe un diseño optimizado para estudiar la cinética del engraftment de células hematopoyéticas por microscopia Intravital de fluorescentes. En este estudio, la expansión de las células progenitoras mieloides en un BM de WT o en una muesca señalización defectuosa BM fue localizada en la bóveda ósea por células mieloides positivas siguientes de Lys-GFP después de BMT en recipientes RBPJWT o RBPJKO. Este enfoque se propone como un modelo que puede aplicarse para responder preguntas similares, …

Materials

Ketamine cocktail	IU School of Medicine		Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextran	Tdb Consultancy	TD150-100mg	Other color dextran may be used.
Andis hair trimmer	Braintree Scientific	CLP-323 75
Gauze sponge	Med Vet International	PK224	4-ply, 2X2
Nair depilatory cream	Commercial store
Saline	Med Vet International	RXSAL-POD1LT	0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringe	Fisher Scientific	14-826-79	28g, 1/2cc
Fine Forceps	Fine Science Tools	00108-11, 00109-11	straight forcep, angled forcep
Scissor	Fine Science Tools	15018-10
Needle holder	Fine Science Tools	12002-14
5-0 silk suture	Fisher Scientific	MV-682	Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dish	WillCo	GWSt-5040
Optical microscope oil	Leica
Stereotaxic stage insert	IU School of Medicine	Custom design
Olympus FV1000 confocal microscope system	Olympus
Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective	Olympus
Small heating pad	Commercial store		Zoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging software	Bitplane		3/4 D Image Visualization and Analysis software