Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek
Summary
İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.
Abstract
Kanıt artan o normal hematopoiesis kritik hematopoetik kök hücre (HSC) işlevleri1,2oransal özel hücresel nişler dahil farklı microenvironmental cues BM içinde düzenlenir gösterir. Nitekim, hematopoetik microenvironment daha ayrıntılı bir resim şimdi, endosteal ve endotel nişler normal HSC ve onların döl3,4,5 düzenlenmesi için işlevsel birimler şeklinde ortaya çıkmaktadır . Yeni çalışmalar Perivasküler hücreleri, adipositler ve bakımı ve HSC işlevi6,7,8düzenleyen nöronal hücre önemini ortaya koymuştur. Ayrıca, kanıt hücreleri farklı soy, Yani myeloid ve lenfoid hücrelerin, ev ve BM microenvironment içinde belirli niş yer alır. Ancak, tam eşleme BM microenvironment ve onun işgalcilere hala devam ediyor.
Lineage belirli floresan işaretçileri veya BM niş belirli hücreleri seçili molekülleri eksikliği için genetik olarak fareler ifade transgenik fare suşları are şimdi elde edilebilir. Knock-out ve modelleri, nakli yaklaşımlar, birlikte izleme soyu sağlamak bilgi özel “niş” rolünü iyileştirmek için fırsatın hücreleri gibi HSC, tanımlanmış hematopoetik nüfus için B-hücreleri, T-hücreleri, myeloid hücrelerin ve erythroid hücreleri. Bu strateji daha fazla hasta İki fotonlu mikroskobu kullanımını birleştirerek potentiated. Vivo içinde yüksek kararlılık düşsel ve 3-b BM hasta işlenmesini sağlayarak, Şimdi tam olarak nerede belirli hematopoetik alt kümeleri içinde BM ana sayfa ve zaman içinde kendi genişleme Kinetik değerlendirmek yerini belirleyebilirsiniz. Burada, Lys-GFP transgenik fareler (myeloid hücrelerin işaretleme)9 ve RBPJ knock-out fareler (kurallı çentik sinyal eksik)10 IVFM ile birlikte bir çentik arızalı BM microenvironment myeloid hücrelerin engraftment belirlemek için kullanılır.
Introduction
İntravital multiphoton Floresans mikroskobu (IVFM) yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı derin dokuların kadar görüntüleme için izin veren bir tekniktir güçlü görüntüleme doku bağlı olarak 1mm. Fare hasta uygulandığında, 60-100 mikron11‘ e non-invaziv bir şekilde hematopoetik hücrelerin içinde BM davranışını gözlemlemek izin verir. Bu yaklaşım burada normal Miyeloid ataları kurallı çentik sinyal eksik RBPJ BM knock-out farelerde engraftment Kinetik belirlemek için kullanılır.
Bizim grup son işten o arızalı kurallı çentik BM microenvironment yol miyoproliferatif benzeri hastalık12içinde sinyal gösterdi. Çentik sinyal kaybı DNA bağlayıcı etki RBPJ, nehrin aşağısında kurallı çentik sinyal, Rekombinasyon10indüklenen Mx1-Cre kullanarak, kritik transkripsiyon faktörü, koşullu silme tarafından elde edildi. Bu çalışmada, Mx1-Cre/RBPJfüme balığı/füme balığı fare modeli kullanılmıştır. Tüm çentik reseptörleri sinyal kaybı RBPJ DNA’ya bağlanıcı motif koşullu silinmesiyle sonuçlanır. Mx1-Cre modelinde, ifade birden çok organlar, kan hücrelerinde de stromal bileşenleri gibi hedeflenen gen silinmesi indüksiyon içinde kaynaklanan polyI:C İdaresi üzerine harekete geçirmek Mx1 organizatörü tarafından tahrik edilmektedir Cre BM, dalak ve karaciğer de dahil olmak üzere.
Mx1-Cre+/RBPJfüme balığı/füme balığı ve Mx1-Cre–/RBPJfüme balığı/füme balığı fare (Bu andan RBPJKO ve RBPJWT, sırasıyla gösterilir) polyI:C ile indüklenen öğrenirim ışınlanmış ve normal, vahşi türü hematopoetik hücreler ile nakledilmektedir. Hafta 4 nakli sonra başlayarak, RBPJKO alıcıları önemli lökositoz splenomegali tarafından takip geliştirdi. BM analizi 4 ve 6 hafta olmadığını göstermiştir RBPJKO fareler Miyeloid ataları artış yüzdesi BM hafta 8 nakli sonra ve daha sonra zaman noktalarda sunulan rağmen myeloid hücre içeriklerini kontrol RBPJWT göre çarpıcı farklılıklar alıcılar. BM microenvironment miyoproliferatif fenotip başlatılması üzerinde doğrudan etkisi olup olmadığını Mx1-Cre farklı hematopoetik organlarda ifade edilir aslında birlikte bu gözlem soru kaldırdı.
BM hastalığın gelişiminin kritik bir başlangıç sitesi olup olmadığını belirlemek için fare hasta IVFM BM nakli (BMT), RBPJ knock-out modeli ve izleme sistemi bir soyu ile birlikte kullanılmıştır. Transgenik fareler EGFP belirli lizozim organizatörü (Lys-GFP)9 kontrol altında ifade BM BMT sonra görüntüleme sırasında görüntülenmeyecektir donör hücreleri elde etmek için kullanılmıştır. Lizozim ifade myeloid hücrelerin belirli ve ortak Miyeloid yaratıcı (CMP) hücrelerden olgun granülosit13Lys-GFP işaretler.
Farklı zaman noktalarda BM IVFM Lys-GFP hücreleri benzer şekilde RBPJWT BM ve RBPJKO alıcıya bağlantılı ama genişletilmiş ve daha hızlı RBPJKO BM alıcıları engrafted gösterdi. Bu fark daha önceki zaman noktada (2. hafta) dramatik ve zamanla azalmıştır (hafta 4 ve 6). Ancak, daha sonra bu zaman noktalarda aynı alıcının hematopoetik kompartımanda değerlendirilmesi karton kapak dolaşan myeloid hücrelerin sayısı sürekli bir artış gösterdi ve RBPJKO fareler, hücreleri artan bir çıkışını gösteren dalak lokalize kan dolaşımı içine BM. Lys-GFP hücreleri yerelleştirme BM içinde transplante farelerin 6 hafta analizi myeloid hücrelerin RBPJKO microenvironment denetimdeki damarlara kadar uzak ikamet ortaya koydu.
Toplu olarak, bu belirli hayvan modelleri ile IVFM birlikte anlayışlar engraftment dynamics RBPJKO BM microenvironment myeloid hücrelerin içinde sağlanan. Deneysel tasarım ve kantitatif yaklaşım burada açıklanan benzer soruları gidermek için uygulanan bir paradigma olarak önerilmiştir. Örneğin, RAG1-GFP14 ya da Gata1-GFP15 fareler gibi modeller, izleme diğer hücre belirli lineage kullanımı lenfoid davranışını izin verebilir veya erythroid ataları, sırasıyla, BM içinde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı hematopoetik hücrelerin engraftment Kinetik çalışmaya Intravital floresan mikroskopi tarafından en iyi duruma getirilmiş bir deneysel tasarım açıklar. Bu çalışmada, myeloid progenitör hücre WT BM veya arızalı BM sinyal bir çentik genişlemesi kemik hasta aşağıdaki Lys-GFP olumlu Miyeloid hücreleri tarafından BMT sonra RBPJWT veya RBPJKO alıcı takip edildi. Bu yaklaşım için adresi benzer sorular, örneğin uygulanabilir bir model olarak önerilmiştir: Ben) genişleme ve di?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Görüntüleme Indiana merkezinde Dr. Ken Dunn tarafından Yönetmen: Indiana Üniversitesi’nde biyolojik mikroskopi için gerçekleştirilmiştir. Stereotaksik aygıtı tasarlanmış ve Mark Soonpaa, Wells Pediatrik Araştırmaları Merkezi tarafından yapılan bir prototiptir. IUSM/Notre Dame (NC) proje NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), MPN Araştırma Vakfı (NC) ve CTSI işbirlikçi, bu eser NIH/R01DK097837-09 (NC) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Ketamine cocktail | IU School of Medicine | Ketamine 90-100mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg | |
| TRITC dextran | Tdb Consultancy | TD150-100mg | Other color dextran may be used. |
| Andis hair trimmer | Braintree Scientific | CLP-323 75 | |
| Gauze sponge | Med Vet International | PK224 | 4-ply, 2X2 |
| Nair depilatory cream | Commercial store | ||
| Saline | Med Vet International | RXSAL-POD1LT | 0.9% Sodium Chloride poly bottle |
| Insulin syringe | Fisher Scientific | 14-826-79 | 28g, 1/2cc |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 00108-11, 00109-11 | straight forcep, angled forcep |
| Scissor | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| 5-0 silk suture | Fisher Scientific | MV-682 | Other non-absorbable suture may be used |
| WillCo- glass bottom dish | WillCo | GWSt-5040 | |
| Optical microscope oil | Leica | ||
| Stereotaxic stage insert | IU School of Medicine | Custom design | |
| Olympus FV1000 confocal microscope system | Olympus | ||
| Olympus XLUMPLFL 20xW, NA 0.95 objective | Olympus | ||
| Small heating pad | Commercial store | Zoo Med reptile heating pad | |
| Imaris 8.1 imaging software | Bitplane | 3/4 D Image Visualization and Analysis software |
Riferimenti
- Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
- Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
- Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
- Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
- Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
- Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
- Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
- Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
- Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
- Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
- Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
- Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
- Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
- Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683 (2014).
