Implementação de um sistema coerente Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) em Ti: Safira e OPO Laser Based Laser Standard Scanning Microscope

Summary

Coherent dispersão anti-Stokes Raman (CARS) Microscopia baseado em vibração inerente de títulos molécula permite imagens de células vivas quimicamente seletiva sem rótulo. Este trabalho apresenta a implementação de uma técnica de microscopia complementar sobre um microscópio de varredura a laser padrão multiphoton baseado em um Ti femtosecond: laser de safira e um laser OPO.

Abstract

microscópios de varredura a laser, combinando a Ti femtosecond: laser de safira e uma óptica oscilador paramétrico (OPO) para duplicar a linha de laser tornaram-se disponíveis para os biólogos. Estes sistemas são projetados principalmente para a microscopia de fluorescência de dois fotões multi-canal. No entanto, sem qualquer modificação, microscopia óptica não-linear complementar, como segundo harmônico geração (SHG) ou terceira geração harmônica (THG) também pode ser realizada com este set-up, permitindo que imagens sem rótulo de moléculas estruturados ou médio aquosa interfaces de lípidos. Estas técnicas são bem adequados para a observação in vivo, mas estão limitados na especificidade química. Quimicamente imagiologia selectivo pode ser obtido a partir de sinais de vibração inerentes com base na dispersão de Raman. A microscopia confocal Raman fornece resolução espacial 3D, mas requer alta potência média e tempo de aquisição de comprimento. Para superar essas dificuldades, avanços recentes na tecnologia laser permitiram a develmento de microscopia óptica vibracional não-linear, em particular coerente anti Stokes-espalhamento Raman (CARS). CARROS microscopia, portanto, surgiu como uma ferramenta poderosa para imagens de células biológicas e ao vivo, por lipídios quimicamente mapeamento (através da vibração de estiramento CH), água (através de vibrações de estiramento OH), proteínas ou DNA. Neste trabalho, descrevemos a implementação da técnica CARROS em um microscópio multiphoton varredura a laser acoplado a OPO padrão. Baseia-se a sincronização em tempo das duas linhas de laser, ajustando o comprimento de um caminho do feixe de laser. Nós apresentamos uma implementação passo-a-passo desta técnica em um sistema multiphoton existente. A formação básica em óptica experimental é útil e o sistema apresentado não requer equipamento adicional caro. Também ilustram CARROS imaging obtidos em bainhas de mielina do nervo ciático de roedor, e mostra-se que esta imagem pode ser realizado simultaneamente com outra imagem óptica não linear, tal como o padrão two-photon técnica de fluorescência e geração de segundo harmônico.

Introduction

A microscopia óptica tornou-se uma importante técnica para visualização não destrutiva de processos dinâmicos em sistemas biológicos vivendo com uma resolução subcelular. Microscopia de fluorescência é atualmente o contraste de imagem mais popular usado em células vivas, devido à sua alta especificidade e sensibilidade ^1. Uma grande paleta de sondas fluorescentes (corantes emergiu exógenos, proteínas geneticamente codificados, nanopartículas de semicondutores). Várias técnicas fluorescente à base de iluminação da amostra floresceram (tal como microscopia confocal ou de dois fotões) realizar imagem 3D e para reduzir uma principal desvantagem desta técnica é que a fotodegradação ^2. Outras limitações incluem a exigência de rotulagem fluoróforo porque a maioria das espécies moleculares não são intrinsecamente fluorescente e, portanto, essas fluoróforos tem que ser introduzido artificialmente na amostra trabalhada. Esta manipulação artificial pode ser prejudicial, especialmente para pequenas moléculas ou induz potcial foto-toxicidade. Estas razões fazem microscopia de fluorescência não adequado para observações in vivo em. Por isso, a utilização de técnicas de imagiologia óptica com alta sensibilidade e contrastes moleculares específicas, sem a utilização de moléculas fluorescentes é altamente desejável em ciências biomédicas.

Várias técnicas de imagem óptica não linear, sem rotulagem ou coloração surgiram, incluindo segundo harmônico geração (SHG) ^3,4 e geração de terceiro harmônico (THG) ^5. Microscopia SHG foi usado para arranjos estruturais de imagem ao nível supramolecular microtúbulos tais como colagénio ou ^6. THG é gerado a partir de heterogeneidades ópticas, tais como a interface entre o meio aquoso e lípidos ^7. THG também foi demonstrada para a imagem de mielina ^8,9. Ambas as técnicas podem ser aplicadas sobre um microscópio de fluorescência de dois fotões e requerem apenas um feixe de laser. No entanto, eles exigem intensidade do laser de alta potência (normalmente 50mW a 860 nm para SHG ^10, 25 – 50 mW a 1180 nm para THG ^9), que é deletério em amostras de vida, e não proporcionam a especificidade química que é necessária para inequivocamente imagem estruturas biológicas específicas.

Quimicamente imagiologia selectivo pode ser obtido a partir de sinais de vibração molecular inerentes com base na dispersão de Raman. Quando um feixe de luz atinge matéria, fotões pode ser absorvida e dispersada pelos átomos ou moléculas. A maior parte dos fotões dispersos terão a mesma energia, ou seja, a frequência, tal como os fotões incidentes. Este processo é chamado de espalhamento Rayleigh. No entanto, um pequeno número de fótons serão espalhadas com uma frequência óptica diferente da frequência dos fótons incidentes, ou seja, com um processo de espalhamento inelástico chamado de espalhamento Raman. A diferença entre a energia provém de excitação de modos vibracionais, dependendo da estrutura molecular e do ambiente. Portanto, Raman espontâneo prov espalhamentoides imagiologia química selectiva como moléculas diferentes têm freqüências vibratórias específicas. No entanto, é limitada por causa de seu sinal extremamente fraco. A microscopia confocal Raman tem sido desenvolvido e fornece resolução espacial 3D, mas requer tempo de alta potência média e longa aquisição ^11. Para superar essas dificuldades, avanços recentes na tecnologia laser têm permitido o aumento da microscopia óptica vibracional não-linear, em particular coerente dispersão anti-Stokes Raman (CARS) ^11,12,13.

CARS é um processo óptico não-linear de terceira ordem. Três feixes de laser, compostas por um feixe de bomba a ω frequência _P, um feixe de Stokes na freqüência ω _S e um feixe de sonda (na maioria das vezes sendo a bomba) estão focados em uma amostra e gerar um feixe de anti-Stokes na freqüência ω _AS = ( 2ω _P – ω _S) ^14. O sinal anti-Stokes podem ser significativamente aumentada, quando a diferença de frequênciaentre a bomba eo Stokes vigas está sintonizado numa Raman molecular vibração Ω _R = (ω _P – ω _S). sinal de CARS é baseado em múltiplos interação fóton. Ele gera, por conseguinte, um sinal coerente ordens de magnitude mais forte do que a dispersão de Raman espontânea.

Microscopia CARS foi primeiro demonstrada experimentalmente por Duncan et al. ^15. Zumbusch et al., Em seguida, melhorou a técnica, usando dois focados feixes de laser femtosegundo do infravermelho próximo com uma lente objetiva de alta abertura numérica, permitindo que a condição de casamento de fase de carros e evitando a dois fótons não-ressonante de fundo ^16. CARROS microscopia, portanto, surgiu como uma ferramenta poderosa para imagens de células e tecidos ao vivo, através da detecção quimicamente moléculas como lipídios (através da vibração de estiramento CH) ^17,18, água (através de vibrações de estiramento OH), proteínas, DNA em células vivas ^19,20 mas também deuterado composto químicos para farmacêutico ²¹ e aplicações cosméticas ^22.

A principal limitação da microscopia não-linear origina a partir da complexidade e do custo das fontes ópticas. Um sistema CARS requer dois lasers ajustáveis ​​comprimento de onda com durações de pulso curto e com trens de pulso temporal e espacialmente sincronizados. Os carros adiantados microscópios foram baseadas em dois picosecond sincronizado Ti: lasers de safira ^20. CARROS imagem também foi obtido a partir de um único Ti femtosecond: laser de safira gerando uma fonte de luz supercontínuo ^23. Recentemente, fontes de laser compostas por um único Ti femtosegundo: laser de safira que bombeia um ópticos osciladores paramétricos sintonizável (OPO) têm sido utilizados para microscopia CARS. Esta configuração permite intrinsecamente temporalmente sincronizado vigas com uma diferença de frequência entre a bomba e o feixe de Stokes que cobre o espectro completo de vibração molecular ^24. Além disso, microscópios de varredura de laser baseado num volume de negócioschave a laser fs e um OPO, usado principalmente para dois fótons de fluorescência (TPF) estão agora disponíveis para os não-físicos. O potencial de tais set-ups pode ser muito maior sem a necessidade de investimento adicional pela incorporação de outra imagem óptica não-linear, uma vez que cada modalidade de imagem não-linear (NLO) é sensível às estruturas ou moléculas específicas. Portanto Multimodal NLO imagem capitaliza o potencial da microscopia NLO para amostras biológicas complexas ^25. O acoplamento destas técnicas permitiu a investigação de muitas perguntas biológicas, em particular sobre o metabolismo de lípidos, a pele ou o cancro de desenvolvimento ^26, desenvolvimento muscular esquelética ^{27, 28} lesões ateroscleróticas. Além disso, a implementação de leitura por feixe de laser com CARS dá a capacidade de processamento de imagem de alta velocidade, ou seja, uma ferramenta atraente para estudar processos dinâmicos in vivo.

O objetivo deste trabalho é mostrar cada passo para implementar ttécnica que ele CARROS em um microscópio padrão de varredura a laser multiphoton. O microscópio é baseado numa Ti FSEC: laser de safira e um OPO (bombeado pelo Ti: Safira laser) operado por um software para biólogos. A integração foi realizada por ajustamento do comprimento de um caminho do feixe de laser, a fim de sincronizar em tempo os dois feixes. Descrevemos a implementação passo-a-passo desta técnica que requer apenas conhecimentos básicos na óptica experimentais. Nós também ilustram CARS Imaging obtidas em bainhas de mielina do nervo ciático de roedores, e nós mostrar-lhe a imagem pode ser realizada simultaneamente com outra imagem óptica não-linear, como técnica de fluorescência de dois fotões padrão e segundo harmônico geração.

Protocol

Figura 1. Representação esquemática do geral set-up Ele inclui a Ti:. Safira (680 – 1080 nm) e a OPO (1.050 – 1.300 nm) lasers, a linha de atraso com os 4 espelhos (M 1 a M 4), o osciloscópio rápido, o fotodiodo e duas íris fixa diafragmas I 1 e I 2. Espelhos M 2 e M 3 são fixados numa fase de translação linea…

Representative Results

A frequência de trem de pulsos de Ti padrão: laser de safira é normalmente em torno de 80 MHz. A OPO tem a mesma frequência, uma vez que é bombeado pelo Ti: Safira laser. Por conseguinte, é necessário um osciloscópio de jejum de pelo menos 200 MHz. Um fotodíodo rápido na gama de 600 também é necessária a 1100 nm. A mudança temporais máxima ocorre quando o Ti: safira e os sinais OPO são deslocados de 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6,2 nanossegundos. Isso correspo…

Discussion

A parte mais desafiadora do trabalho é a sincronização temporal dos feixes de laser. Exige um fotodíodo rápido combinado com um osciloscópio rápido, mas apenas uma sobreposição áspera no tempo pode ser realizada em primeiro lugar. Em seguida, é necessário um novo ajustamento de alguns cm. Finalmente, micrômetro se move por uma fase de tradução linear permite realizar o ajuste fino do final do comprimento da linha de atraso para acionar o sinal de CARS. Este sinal é mantida numa gama estreita de cerca de …

Materials

Oscilloscope	Tektronix	TDS 520D	500 MHz
Photodetector	Thorlabs	DET08C/M, T4290	5 GHz InGaAs, 800-1700 nm
Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II	Coherent
Optical parametric oscillator OPO Compact Family	APE Berlin
Axio Examiner microscope LSM 7 MP	Carl Zeiss
Motorized periscope	Newport
Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0	Carl Zeiss
Beam combiner	Carl Zeiss
Acousto-optic modulator	Carl Zeiss
OPO power attenuator	Carl Zeiss
Photomultiplier tube	Carl Zeiss
ZEN software	Carl Zeiss
Bandpass filters	Carl Zeiss	LSM BiG 1935-176	400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm
Dichroic mirror	Carl Zeiss		Cutoff wavelength 760 nm
Silver mirrors	Newport	10D20ER.2	λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4
Single-axis translation stage with standard micrometer	Thorlabs	PT1/M	Quantity 1
Aluminium breadboard	Thorlabs	MB1015/M	Quantity 1
Mirror mount	Thorlabs	KMSS/M	Quantity 4
Mirror holder for Ø1" Optics	Thorlabs	MH25	Quantity 4
Iris diaphragms	Thorlabs	ID8/M	Quantity 3
Protective box	Thorlabs	TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S	Quantity 1
Optical posts	Thorlabs	TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M	Quantity 8 (lengths depending on the set-up)
661-690 nm bandpass filter	Semrock	676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter	Quantity 1
Fluorescent beads	ThermoFisher	TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit
Laser viewing card	Thorlabs		IR laser viewing card
Laser safety glass	Newport	LV-F22.P5L07
FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain	ThermoFisher	F34652