蓝宝石OPO基于激光的标准激光扫描显微镜：在TI相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）系统的实现
Summary
根据分子键固有振动相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微允许无标记化学选择性活细胞成像。这项工作提出了一种基于飞秒钛互补显微技术在标准的多光子激光扫描显微镜实现：蓝宝石激光器和激光OPO。
Abstract
激光扫描显微镜结合飞秒钛宝石激光器和光学参量振荡器（OPO）复制激光线已经成为可供生物学家。这些系统的设计主要是用于多通道的双光子荧光显微镜。然而，在没有任何修改，补充非线性光学显微镜如二次谐波产生（SHG）或第三谐波（THG）也可以使用这组时执行，使构成分子或含水中期的无标记成像脂质接口。这些技术非常适合于在生物体内的观察，但在化学特异性有限。化学选择性成像可以基于拉曼散射固有振动信号来获得。共焦显微拉曼光谱提供了三维空间分辨率，但它需要高平均功率，长采集时间。为了克服这些困难，最近在激光技术的进步已经允许DEVEL非线性光学振动显微镜opment，特别是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）。因此CARS显微镜已成为生物和活细胞成像的有力工具，通过化学映射脂质（通过CH伸缩振动），水（经由OH拉伸振动），蛋白质或DNA。在这项工作中，我们描述了CARS技术在一个标准的OPO耦合多光子激光扫描显微镜的执行。它是基于通过调节激光束的路径中的一个的长度的两个激光线的在时间同步。我们目前现有的多光子系统上一步一步实现这个技术的。在实验光学的基本背景是有益的，所提出的系统不需要昂贵的配套设备。我们还说明CARS成像于啮齿动物的坐骨神经的髓磷脂鞘获得，并且我们表明，该成像可以同时与其他的非线性光学成像，如标准的T进行WO光子荧光技术和二次谐波产生。
Introduction
光学显微镜已经成为在活生物系统具有亚细胞分辨率的动态过程的无损可视的主要技术。荧光显微镜当前在活细胞中使用的最流行 的成像造影由于其高特异性和灵敏度1。荧光探针的大型面板已经出现了（外源性色素，基因编码的蛋白质，半导体纳米粒子）。各种样品照明基于荧光的技术已经蓬勃发展（如共焦或双光子显微镜）来执行3D成像，并减少该技术被漂白2的主要缺点。其它限制包括荧光团标记的要求，因为大多数分子种类并不固有荧光，因此，这些荧光团必须被成像样品中人为地引入的。这种人为操纵可能是破坏性尤其是小分子或诱导锅无穷区间的光毒性。这些原因使得荧光显微镜不能很好地适用于体内的观察。因此，在不使用荧光分子的使用的具有高灵敏度和特异性的分子的对比光学成像技术是在生物医学科学高度期望的。
无标签或染色的几个非线性光学成像技术已经出现，包括二次谐波产生（SHG）3,4和三次谐波产生（THG）5。 SHG显微镜已被用于图像的结构安排在超分子水平，如微管或胶原6。 THG从光学不均匀性产生的诸如水性介质和脂质7之间的界面。 THG也证明图像髓鞘8,9。这两种技术都可以在双光子荧光显微镜来实现，并且只需要一个激光束。不过，他们需要高功率激光强度（一般为50毫瓦对于SHG 10,25 860纳米- 50毫瓦对于THG 9 1180毫微米），它是活样品中的有害，并且不提供其需要明确图像特定生物结构的化学特异性。
化学选择性成像可以基于拉曼散射固有分子振动信号来获得。当一束光事项命中，光子可以被吸收并通过原子或分子散射。大部分的散射光子将具有相同的能量， 即，频率，作为入射的光子。这个过程被称为瑞利散射。然而，光子少数将分散在从入射光子， 即频率不同的光频率，与称为拉曼散射的非弹性散射过程。的能量差，从取决于分子结构和环境振动模式激发起源。因此，自发拉曼散射省化学的IDE选择性成像不同的分子具有特定的振动频率。然而，它是因为它极其微弱信号的限制。共焦拉曼显微镜已经开发，并提供了三维空间分辨率，但它需要高平均功率和长采集时间11。为了克服这些困难，最近在激光技术的进步已经允许非线性光学振动显微镜的上升，特别是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）11,12,13。
CARS是一个三阶非线性光学过程。三个激光束，在频率ωP上泵浦光束组成，在频率ωS A斯托克斯光束和一个探测光束（通常是泵）被聚焦在样品中，并产生在频率ω 的AS =反司托克斯束（ 2ω 对 – ωS）14。在反司托克斯信号可以显著增强时的频率差（ – ω 小号 ωP）的泵和斯托克斯光束被调谐到的拉曼分子振动ΩR =之间。 CARS信号是基于多光子相互作用。因此，它产生要比自发拉曼散射更强的相干信号的订单。
CARS显微镜首先通过实验邓肯等人 15表明。 Zumbusch 等人则改善的技术中，通过使用两个聚焦的近红外飞秒激光束具有高数值孔径的物镜，从而使轿厢的相位匹配条件，并避免了双光子非共振背景16。因此CARS显微镜已作为活细胞和组织成像的有力工具，通过在活细胞19,20化学检测分子，例如脂质（经由CH伸缩振动）17,18，水（经由OH拉伸振动），蛋白质，DNA而且氘代化合物S表示药物21和化妆品应用22。
非线性显微镜的主要限制从复杂性和光学源的成本起源。一个CARS系统需要短脉冲持续时间，并与时间和空间的同步脉冲串双波长可调谐激光器。早期的汽车显微镜是基于两个同步皮秒钛宝石激光器20。蓝宝石激光器产生超连续谱光源23：也从单一的飞秒钛获得CARS成像。最近，一个单一的飞秒钛组成的激光源：蓝宝石激光器泵浦的可调光参量振荡器（OPO）已用于CARS显微镜。这种设置允许内在时间上同步梁频率的泵和斯托克斯光束覆盖整个分子振动光谱24之间的差。此外，根据唱机激光扫描显微镜关键飞秒激光和OPO，主要用于双光子荧光（TPF）现在可用于非物理学家。这样调校的电位，可大大提高，而不需要通过其他的非线性光学成像的掺入补充投资，因为每个非线性（NLO）成像模态是将特定结构或分子敏感。因此，多模态的非线性光学成像大写非线性光学显微镜对复杂生物样品25的潜力。这些技术的耦合允许的许多生物的问题调查，特别是对脂质代谢，皮肤或癌症的发展26，骨骼肌发育27，动脉粥样硬化病变28。而且，随着CARS激光束扫描的实现提供高速率成像， 即一个有吸引力的工具来研究体内动力学过程的能力。
这个工作的目的是，以显示每个步骤来实现吨在一个标准的多光子激光扫描显微镜他CARS技术。显微镜是基于一个FSEC钛蓝宝石激光器和OPO（由钛泵浦：蓝宝石激光器）通过生物学家软件操作。通过调整，以便在时间上两个光束同步的激光束路径中的一个的长度进行积分。我们描述了一步一步的实现这种技术只要求在实验光学的基本背景。我们还说明了对啮齿动物的坐骨神经的髓磷脂鞘得到CARS成像，并且我们显示可以与其它的非线性光学成像同时执行这种成像，如标准双光子荧光技术和二次谐波产生。
Protocol
Representative Results
Discussion
工作中最具挑战性的部分是激光束的时间同步。它需要一个快速光电二极管具有快速示波器组合，但是可以在第一执行只在时间粗略重叠。然后几个厘米的进一步调整是必需的。最后，由线性平移平台微米移动以触发CARS信号允许执行延迟线长度的最终微调。这个信号被维持在一个窄的范围内大约20微米，通过调整平移台测微驱动器作为观察。它对应于约一半的脉冲持续时间， 即，140 FSEC的?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
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