Gennemførelse af en sammenhængende Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System på en Ti: Sapphire og OPO laserbaseret Standard Laser Scanning Microscope
Summary
Sammenhængende anti-Stokes Raman spredning (CARS) mikroskopi baseret på iboende vibration af molekyle obligationer tillader label-fri kemisk selektiv levende celler. Dette arbejde viser gennemførelsen af en supplerende mikroskopi teknik på en standard multifoton laser scanning mikroskop baseret på et femtosekund Ti: safir laser og en OPO laser.
Abstract
Laser scanning mikroskoper kombinerer en femtosekund Ti: safir laser og en optisk parametrisk oscillator (OPO) at duplikere laser linje er blevet tilgængelige for biologer. Disse systemer er primært designet til multi-kanal to-foton fluorescens mikroskopi. Men uden nogen ændring, supplerende ikke-lineær optisk mikroskopi, såsom anden harmonisk generation (SHG) eller tredje harmoniske generation (THG) kan også udføres med denne opsætning, så etiketten uden billeddannelse af strukturerede molekyler eller vandig mellem- lipid grænseflader. Disse teknikker er velegnede til in vivo observation, men er begrænset i kemisk specificitet. Kemisk selektiv billeddannelse kan opnås fra iboende vibrationssignaler baseret på Raman-spredning. Konfokal Raman mikroskopi giver 3D rumlig opløsning, men det kræver høj gennemsnitlig effekt og lang erhvervelse tid. For at overvinde disse vanskeligheder, har de seneste fremskridt inden for laserteknologi tilladt udvikling af ikke-lineær optisk vibrations mikroskopi, især sammenhængende anti-Stokes Raman spredning (CARS). CARS mikroskopi har derfor vist sig som et effektivt værktøj til biologisk og levende celler ved kemisk kortlægning lipider (via CH stræk vibration), vand (via OH stretch vibrationer), proteiner eller DNA. I dette arbejde, vi beskriver gennemførelsen af CARS teknik på en standard OPO-koblede multifoton laser scanning mikroskop. Den er baseret på den in-time synkronisering af de to laserlinjer ved at justere længden af en af laserstrålevejen. Vi præsenterer en trin-for-trin gennemførelse af denne teknik på en eksisterende multifoton system. En grundlæggende baggrund i eksperimentel optik er nyttige og præsenterede systemet ikke kræver dyrt supplerende udstyr. Vi illustrerer også CARS imaging opnået på myelinskeder af iskiasnerven af gnaver, og vi viser, at denne imaging kan udføres samtidig med andre ikke-lineær optisk billeddannelse, såsom standard tWO-foton fluorescens-teknik og anden-harmonisk generation.
Introduction
Optisk mikroskopi er blevet en vigtig teknik til ikke-destruktiv visualisering af dynamiske processer i levende biologiske systemer med en subcellulær opløsning. Fluorescensmikroskopi er i øjeblikket den mest populære billeddannelse kontrast, der anvendes i levende celler på grund af sin høje specificitet og følsomhed 1. En stor palet af fluorescerende prober er opstået (exogene farvestoffer, genetisk indkodede proteiner, halvleder nanopartikler). Forskellige belysningsstyrke prøve fluorescerende teknikker har blomstrede (såsom konfokal eller to-foton mikroskopi) at udføre 3D billedbehandling og at reducere en største ulempe ved denne teknik, der er fotoblegning 2. Andre begrænsninger omfatter kravet om fluoroforen mærkning, fordi de fleste af molekylære arter er ikke i sig selv fluorescerende og har derfor kunstigt indført i det afbildede prøve disse fluoroforer. Denne kunstige manipulation kan være forstyrrende især for små molekyler eller inducerer potrentielle foto-toksicitet. Disse grunde gør fluorescensmikroskopi ikke velegnet til in vivo observationer. Derfor er brugen af optiske billeddannende teknikker med høj følsomhed og specifikke molekylære kontraster uden anvendelse af fluorescerende molekyler er meget ønskeligt i biomedicinsk videnskab.
Flere ikke-lineære optiske billeddiagnostiske teknikker uden mærkning eller farvning er opstået, herunder anden-harmoniske generation (SHG) 3,4 og tredje-harmonisk generation (THG) 5. SHG mikroskopi er blevet brugt til billedet strukturelle ordninger på supramolekylære niveau såsom mikrotubuli eller kollagen 6. THG genereres fra optiske heterogeniteter, såsom grænsefladen mellem et vandigt medium og lipider 7. THG blev også demonstreret af billedet myelin 8,9. Begge teknikker kan gennemføres på en to-foton fluorescens mikroskop og kun kræve en laserstråle. Men de kræver høj effekt laser intensitet (typisk 50mW ved 860 nm for SHG 10, 25 – 50 mW ved 1.180 nm for THG 9), som er skadelig i levende prøver, og ikke giver den kemiske specificitet, der kræves til entydigt billede specifikke biologiske strukturer.
Kemisk selektiv billeddannelse kan opnås fra iboende molekylære vibrationer signaler baseret på Raman-spredning. Når en lysstråle rammer stof, kan fotoner absorberes og spredt af atomer eller molekyler. De fleste af de spredte fotoner vil have den samme energi, dvs. frekvens, som de indfaldende fotoner. Denne proces kaldes Rayleigh-spredning. Imidlertid vil et lille antal fotoner blive spredt ved en optisk frekvens forskellig fra frekvensen af de indfaldende fotoner, dvs., med en uelastisk spredning proces kaldet Raman-spredning. Forskellen i energi stammer fra excitation af vibrationsformer afhængigt molekylære struktur og miljø. Derfor spontan Ramanspredning provides kemisk selektiv billeddannelse som forskellige molekyler har specifikke vibrationsfrekvenser. Men det er begrænset på grund af sin ekstremt svagt signal. Konfokal Raman mikroskopi er udviklet og giver 3D rumlig opløsning, men det kræver høj gennemsnitlig effekt og lang erhvervelse tid 11. For at overvinde disse vanskeligheder, har de seneste fremskridt inden for laserteknologi tillod fremkomsten af ikke-lineær optisk vibrations mikroskopi, især sammenhængende anti-Stokes Raman spredning (CARS) 11,12,13.
BILER er en tredje ordens lineære optiske proces. Tre laserstråler, der består af en pumpe stråle mod frekvens ω P, er en Stokes stråle mod frekvens ω S og en sonde stråle (oftest er den pumpe) fokuserede i en prøve og generere en anti-Stokes stråle ved frekvensen ω AS = ( 2ω P – ω S) 14. Den anti-Stokes-signalet kan blive væsentligt forbedret, når frekvensforskellenmellem pumpen og Stokes bjælker indstilles til en Raman molekylær vibration Ω R = (ω P – ω S). CARS signal er baseret på multipel foton interaktion. Det genererer derfor en sammenhængende signal størrelsesordener stærkere end spontan Raman spredning.
CARS mikroskopi blev først eksperimentelt påvist af Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Forbedres derefter teknikken, ved anvendelse af to fokuserede nær-infrarøde femtosekund laserstråler med en objektivlinse med høj numerisk apertur, således at fase matching tilstand af biler og undgå de to-foton ikke-resonant baggrund 16. CARS mikroskopi har derfor vist sig som et effektivt værktøj til levende celler og væv billeddannelse ved kemisk detektion molekyler såsom lipider (via CH stretch vibration) 17,18, vand (via OH stretch vibrationer), proteiner, DNA i levende celler 19,20 men også deutereret kemisk forbindelses til farmaceutisk 21 og kosmetiske anvendelser 22.
Den største begrænsning af ikke-lineær mikroskopi stammer fra kompleksiteten og omkostningerne ved de optiske kilder. En CARS system kræver to bølgelængde afstemmelige lasere med korte puls varigheder og med tidsmæssigt og rumligt synkroniserede puls tog. Tidlige CARS mikroskoper var baseret på to synkroniseret picosekund Ti: safir lasere 20. CARS billeddannelse blev også opnået fra en enkelt femtosekund Ti: safir laser genererer en superkontinuum lyskilde 23. For nylig, laser kilder bestående af en enkelt femtosekund Ti: har safir laser pumpe en justerbar optiske parametriske oscillatorer (OPO) været brugt til CARS mikroskopi. Denne opsætning giver reelt tidsmæssigt synkroniseret bjælker med en forskel på frekvens mellem pumpen og Stokes stråle, der dækker det fulde molekylære vibrationelle spektrum 24. Desuden laserscanningmikroskoper baseret på en omsætningnøgle fs laser og en OPO, primært anvendes til to-foton fluorescens (TPF) er nu tilgængelige for ikke-fysikere. Potentialet i sådanne opsætninger kan stærkt forbedret uden at kræve yderligere investeringer ved inkorporering af andre ikke-lineær optisk billeddannelse, da hver lineær (NLO) imaging modalitet er følsomme over for specifikke strukturer eller molekyler. Multimodal NLO imaging udnytter derfor potentialet i NLO mikroskopi for komplekse biologiske prøver 25. Koblingen af disse teknikker har muliggjort undersøgelse af mange biologiske spørgsmål, navnlig på lipidmetabolisme, hud eller cancerudvikling 26, skeletmuskel udvikling 27, atherosklerotiske læsioner 28. Desuden gennemførelsen af laserstrålescanning med CARS giver evnen til high-rate billedbehandling, dvs en tiltalende værktøj til at studere dynamiske processer in vivo.
Formålet med dette arbejde er at vise hvert trin at gennemføre than CARS teknik på en standard multifoton laser scanning mikroskop. Mikroskopet er baseret på en fsec Ti: safir laser og en OPO (pumpes af Ti: safir laser) drives af en software til biologer. Integrationen blev udført ved at justere længden af en af laserstrålens vej for at synkronisere i gang de to bjælker. Vi beskriver trin-for-trin gennemførelsen af denne teknik, som kun kræver grundlæggende baggrund i eksperimentelle optik. Vi illustrerer også CARS Imaging opnået på myelinskeder af iskiasnerven af gnavere, og vi viser denne imaging kan udføres samtidig med andre ikke-lineær optisk billeddannelse, såsom standard to-foton fluorescens teknik og anden-harmoniske generation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest udfordrende del af arbejdet er den tidsmæssige synkronisering af laserstråler. Det kræver en hurtig fotodiode kombineret med en hurtig oscilloskop, men kun et groft overlappende i tid kan udføres ved først. Derefter kræves en yderligere justering af få cm. Endelig mikrometer flytter ved en lineær oversættelse etape tillader udfører den endelige finjustering af forsinkelsen linje længde for at udløse CARS signal. Dette signal holdes i et snævert område på omkring 20 mikrometer, som observeres ved …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
Riferimenti
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. . Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
- Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
- Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
- Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
- Mukamel, S. . Principles of nonlinear optical spectroscopy. , (1995).
- Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
- Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
- Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -. B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
- Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
- Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106 (2011).
- Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
- Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).
- Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
- Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007 (2007).
- Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O’Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
- Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
- Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
- Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
- King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
- Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
- Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
- Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).
