Implementatie van een Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System op een Ti: Sapphire en OPO laser gebaseerde Standard laser scanning microscoop
Summary
Coherente anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopie gebaseerd op inherente trilling van molecuul obligaties maakt label-free chemisch selectieve live cell imaging. Dit werk toont de uitvoering van een aanvullende microscopietechniek op een standaard multifoton laser scanning microscoop gebaseerd op een femtoseconde Ti: saffier laser en een OPO laser.
Abstract
Laser scanning microscopen combineren van een femtoseconde Ti: saffier laser en een optische parametrische oscillator (OPO) om de laser lijn te dupliceren zijn beschikbaar voor biologen geworden. Deze systemen zijn voornamelijk ontworpen voor multi-channel twee-foton fluorescentiemicroscopie. Echter, zonder enige wijziging, aanvullende non-lineaire optische microscopie, zoals de tweede-harmonische generatie (SHG) of derde harmonische generatie (THG) kan ook worden uitgevoerd met deze set-up, waardoor label-free imaging van gestructureerde moleculen of waterige middellange lipide interfaces. Deze technieken zijn zeer geschikt voor in-vivo observatie, maar zijn beperkt chemische specificiteit. Chemisch selectieve beeldvorming kan worden verkregen uit inherent trillingen signalen op basis van Raman scattering. Confocale Raman microscopie biedt 3D-ruimtelijke resolutie, maar het vereist een hoge gemiddelde vermogen en lange acquisitie tijd. Om deze problemen op te lossen, hebben recente ontwikkelingen in lasertechnologie de ont toegestaanwikkeling van niet-lineaire optische vibratie microscopie, in het bijzonder coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopie Daarom heeft ontpopt als een krachtig instrument voor biologische en live cell imaging, door het chemisch mapping lipiden (via CH stretch trillingen), water (via OH stretch trillingen), eiwitten of DNA. In dit werk beschrijven we de uitvoering van de CARS-techniek op een standaard-OPO gekoppeld multiphoton laser scanning microscoop. Het is gebaseerd op de in-tijdsynchronisatie van de twee laserlijnen door de lengte van een van de laserstraal pad. Wij presenteren een stap-voor-stap uitvoering van deze techniek op een bestaande multiphoton systeem. Een eenvoudige achtergrond in experimentele optiek is behulpzaam en de gepresenteerde systeem vereist geen dure aanvullende apparatuur. We tonen ook CARS afbeelden opgehaald op myelineschede van heupzenuw van knaagdieren, en laten we zien dat deze beeldvorming gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd met andere niet-lineaire optische beeldvorming, zoals standaardtwo-foton fluorescentie-techniek en de tweede-harmonische generatie.
Introduction
Optische microscopie is een belangrijke techniek voor destructieve visualisatie van dynamische processen in levende biologische systemen met een subcellulaire resolutie. Fluorescentiemicroscopie is momenteel de meest populaire imaging contrast gebruikt in levende cellen door zijn hoge specificiteit en gevoeligheid 1. Een groot palet van fluorescerende probes is ontstaan (exogene kleurstoffen, genetisch gecodeerde eiwitten, halfgeleider nanodeeltjes). Verschillende sample belichting fluorescerende gebaseerde technieken bloeide (zoals confocale of twee-foton microscopie) voor 3D beeldvorming uit te voeren en een grootste nadeel van deze techniek is fotobleken 2 verminderen. Andere beperkingen zijn de verplichting fluorofoor labeling aangezien de meeste moleculaire soorten niet intrinsiek fluorescerend en bijgevolg worden fluoroforen moeten kunstmatig worden geïntroduceerd in de afgebeelde monster. Deze kunstmatige manipulatie kan in het bijzonder storend zijn voor kleine moleculen of induceert pottiële foto-toxiciteit. Deze redenen maken fluorescentiemicroscopie niet goed geschikt voor in-vivo observaties. Derhalve wordt de toepassing van optische beeldvorming met een hoge gevoeligheid en specifieke moleculaire contrasten zonder gebruik van fluorescerende moleculen in biomedische wetenschap zeer wenselijk.
Verschillende niet-lineaire optische beeldvorming zonder etikettering of vlekken ontstaan, met inbegrip van de tweede-harmonische generatie (SHG) 3,4 en derde-harmonische generatie (THG) 5. SHG microscopie werd gebruikt om het structurele regeling op supramoleculaire niveau zoals microtubuli of collageen 6. THG wordt opgewekt uit optische heterogeniteiten als interface tussen een waterig medium en lipiden 7. THG werd ook aangetoond dat het myeline 8,9. Beide technieken kunnen worden uitgevoerd op een twee-foton fluorescentiemicroscoop en vereisen slechts een laserstraal. Maar ze vereisen een hoog vermogen laser-intensiteit (doorgaans 50mW bij 860 nm voor SHG 10, 25 – 50 mW bij 1180 nm voor THG 9), die schadelijk is in levende monsters, en voorzien niet in de chemische specificiteit die nodig is om op ondubbelzinnige wijze het specifieke biologische structuren.
Chemisch selectieve beeldvorming kan worden verkregen uit inherent vibratiespectroscopie signalen op basis van Raman scattering. Wanneer een lichtstraal raakt Overigens kan fotonen worden geabsorbeerd en verstrooid door atomen of moleculen. De meeste van de verstrooide fotonen wordt dezelfde energie, dat wil zeggen, frequentie als de invallende fotonen. Dit proces heet Rayleigh verstrooiing. Echter een klein aantal fotonen verstrooid op een optische frequentie verschillend van de frequentie van de invallende fotonen, dwz een inelastische verstrooiing genoemd Raman verstrooiing. Het verschil in energie is afkomstig van excitatie van vibrationele modes afhankelijk van de moleculaire structuur en milieu. Daarom spontane Raman scattering provides chemisch selectieve beeldvorming als verschillende moleculen hebben specifieke trillingsfrequenties. Het is echter beperkt vanwege de extreem zwak signaal. Confocale Raman microscopie ontwikkeld en biedt 3D ruimtelijke resolutie, maar vereist hoog gemiddeld vermogen en lange acquisitietijd 11. Om deze moeilijkheden te overwinnen, recente ontwikkelingen in de lasertechnologie hebben toegelaten dat de opkomst van niet-lineaire optische vibratie microscopie, in het bijzonder coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) 11,12,13.
CARS is een derde-orde niet-lineaire optische proces. Drie laserstralen, bestaande uit een pompbundel bij frequentie ω P, een Stokes straal bij frequentie ω S en een testbundel (meestal zijn de pomp) gericht in een monster en het genereren van een anti-Stokes straal bij frequentie ω AS = ( 2ω P – ω S) 14. De anti-Stokes signaal kan aanzienlijk worden versterkt wanneer het frequentieverschiltussen de pomp en de Stokes balken is afgestemd op een Raman vibratiespectroscopie Ω = R (ω P – ω S). CARS signaal op basis van meerdere fotonen interactie. Het genereert dan ook een coherent signaal ordes van grootte sterker dan spontane Raman scattering.
CARS microscopie werd eerst experimenteel aangetoond door Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Verbeterde vervolgens de techniek door twee gerichte nabij-infrarood femtoseconde laserbundels met een objectieflens van een hoge numerieke apertuur, waardoor de phase matching voorwaarde CARS en worden de twee-foton niet-resonante 16 achtergrond. CARS microscopy heeft daarom ontwikkeld tot een krachtig hulpmiddel voor in levende cellen en weefsels imaging, door chemische detecteren moleculen zoals lipiden (via CH strekvibratie) 17,18, water (via OH rek trillingen), eiwitten, DNA in levende cellen 19,20 maar ook gedeutereerde chemische verbindings voor de farmaceutische en cosmetische toepassingen 21 22.
De belangrijkste beperking van lineaire microscopie afkomstig van de complexiteit en de kosten van de optische bronnen. Een CARS systeem vereist twee golflengte afstembare lasers met korte puls duur en met tijd en ruimte gesynchroniseerde puls treinen. Vroege CARS microscopen waren gebaseerd op twee gesynchroniseerde picoseconde Ti: saffier lasers 20. CARS imaging werd ook verkregen uit één femtoseconde Ti: saffier laser genereren van een supercontinuum lichtbron 23. Onlangs laserbronnen uit één enkel femtoseconde Ti: saffier laser is het pompen van een afstembare optische parametrische oscillatoren (OPO) gebruikt voor CARS microscopie. Deze set-up maakt intrinsiek tijdelijk gesynchroniseerd balken met een verschil van frequentie tussen de pomp en de Stokes bundel die het volledige moleculaire vibratiespectrum 24. Bovendien laser scanning microscoop gebaseerd op omzetkey fs laser en een OPO, in de eerste plaats gebruikt voor twee-foton fluorescentie (TPF) zijn nu beschikbaar voor niet-fysici. Het potentieel van een dergelijke set-ups kan sterk worden verbeterd, zonder dat aanvullende investeringen door de incorporatie van andere niet-lineaire optische beeldvorming, aangezien elke niet-lineaire (NLO) beeldvormingmodaliteit gevoelig is voor specifieke structuren of moleculen. Multimodale beeldvorming NLO kapitaliseert dus het potentieel van NLO microscopie voor complexe biologische monsters 25. De koppeling van deze technieken is het onderzoeken van vele biologische vragen toegestaan, met name op de vetstofwisseling, huid of kanker ontwikkelen 26, skeletspier ontwikkeling 27, atherosclerotische lesies 28. Bovendien is de toepassing van laserstralen met CARS geeft het vermogen van hoge frequentie imaging, dwz een aantrekkelijk middel om dynamische processen in vivo.
Het doel van dit werk is om elke stap uit te voeren t tonenhij CARS-techniek op een standaard multiphoton laser scanning microscoop. De microscoop is gebaseerd op een FSEC Ti: saffier laser en een OPO (door de gepompte Ti: saffier laser) bediend door een software voor biologen. De integratie werd uitgevoerd door de lengte van een van de laserstraal pad om te synchroniseren tijdig de twee bundels. We beschrijven de stap-voor-stap uitvoering van deze techniek die op basisachtergrond experimentele optica nodig. We illustreren ook CARS beeldvorming verkregen op myelineschede van heupzenuw van knaagdieren, en laten we deze beeldvorming kan gelijktijdig worden uitgevoerd met andere niet-lineaire optische beeldvorming, zoals standaard twee-foton fluorescentie-techniek en de tweede-harmonische generatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest uitdagende gedeelte van het werk is de tijd synchroniseren van de laserstralen. Het vereist een snelle fotodiode gecombineerd met een snelle oscilloscoop, maar slechts een ruwe overlapping in de tijd kan worden uitgevoerd op het eerste. Dan is een verdere aanpassing van enkele cm is vereist. Tenslotte micrometer beweegt met een lineaire translatietafel maakt het uitvoeren van de uiteindelijke fijnafstelling van de vertragingslijn lengte teneinde het CARS kan activeren. Dit signaal wordt in een smal traject van …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
Riferimenti
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. . Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
- Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
- Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
- Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
- Mukamel, S. . Principles of nonlinear optical spectroscopy. , (1995).
- Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
- Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
- Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -. B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
- Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
- Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106 (2011).
- Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
- Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).
- Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
- Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007 (2007).
- Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O’Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
- Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
- Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
- Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
- King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
- Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
- Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
- Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).
