Coherent diffusion anti-Stokes Raman (CARS) microscopie basée sur les vibrations inhérentes de liaisons moléculaires permet chimiquement sélective imagerie des cellules vivantes sans étiquette. Ce travail présente la mise en œuvre d'une technique de microscopie complémentaire sur un microscope à balayage laser multiphotonique standard basé sur un Ti femtoseconde: laser saphir et un laser OPO.
microscopes à balayage laser combinant un Ti femtoseconde: laser saphir et un oscillateur paramétrique optique (OPO) pour dupliquer la ligne laser sont devenus disponibles pour les biologistes. Ces systèmes sont conçus principalement pour multivoie microscopie par fluorescence à deux photons. Cependant, sans aucune modification, la microscopie optique non linéaire complémentaire comme deuxième génération de l'harmonique (SHG) ou troisième génération harmonique (THG) peut également être effectuée avec ce set-up, ce qui permet l'imagerie sans étiquette de molécules structurées ou moyen aqueuse les interfaces lipidiques. Ces techniques sont bien adaptés à l' observation in vivo, mais sont limités dans la spécificité chimique. Chimiquement imagerie sélective peut être obtenue à partir de signaux de vibrations inhérentes basées sur la diffusion Raman. Confocale microscopie Raman offre une résolution spatiale en 3D, mais il nécessite une puissance moyenne élevée et de longue durée d'acquisition. Pour surmonter ces difficultés, les progrès récents dans la technologie laser ont permis l'develloppement de la microscopie non linéaire de vibration optique, en particulier anti-Stokes cohérente de diffusion Raman (CARS). Microscopie CARS a donc émergé comme un outil puissant pour l'imagerie cellulaire biologique et en direct, par les lipides de cartographie chimique (par vibration CH stretch), l'eau (via OH vibrations d'étirement), des protéines ou de l'ADN. Dans ce travail, nous décrivons la mise en œuvre de la technique CARS sur un balayage laser multiphotonique microscope OPO couplé standard. Elle est basée sur la synchronisation dans le temps des deux lignes laser en ajustant la longueur de l'un du trajet du faisceau laser. Nous présentons une mise en œuvre étape par étape de cette technique sur un système multiphotonique existant. Une formation de base en optique expérimentale est utile et le système présenté ne nécessite aucun équipement supplémentaire coûteux. Nous illustrons également CARS imagerie obtenus sur les gaines de myéline de nerf sciatique de rongeur, et nous montrons que cette imagerie peut être réalisée simultanément avec d'autres imagerie optique non linéaire, telle que la norme two-photon technique de fluorescence et de génération de seconde harmonique.
La microscopie optique est devenue une technique importante pour la visualisation non destructive de processus dynamiques dans des systèmes biologiques vivants avec une résolution subcellulaire. La microscopie à fluorescence est actuellement le contraste d'imagerie le plus populaire utilisé dans les cellules vivantes en raison de sa haute spécificité et la sensibilité 1. Une large palette de sondes fluorescentes a émergé (colorants exogènes, les protéines codées génétiquement, des nanoparticules de semi-conducteurs). Diverses techniques fluorescentes à base illumination de l' échantillon ont fleuri (telles que la microscopie confocale ou à deux photons) pour effectuer l' imagerie 3D et de réduire un inconvénient principal de cette technique qui est photoblanchiment 2. D'autres limitations comprennent l'exigence de l'étiquetage fluorophore parce que la plupart des espèces moléculaires ne sont pas intrinsèquement fluorescent et par conséquent, ces fluorophores doivent être introduits artificiellement dans l'échantillon imagé. Cette manipulation artificielle peut être perturbatrice, en particulier pour les petites molécules ou induit potphoto-toxicité tiel. Ces raisons font microscopie par fluorescence ne conviennent pas pour les observations in vivo. Par conséquent, l'utilisation de techniques d'imagerie optique à haute sensibilité et contrastes moléculaires spécifiques sans l'utilisation de molécules fluorescentes est hautement souhaitable dans la science biomédicale.
Plusieurs techniques d'imagerie optique non linéaire sans étiquetage ou la coloration ont émergé, y compris la deuxième génération de l' harmonique (SHG) 3,4 et troisième génération harmonique (THG) 5. SHG microscopie a été utilisée pour l' image des arrangements structurels au niveau supramoléculaire tels que les microtubules ou le collagène 6. THG est généré à partir hétérogénéités optiques tels que l' interface entre un milieu aqueux et les lipides 7. THG a également été démontrée à l' image de la myéline 8,9. Les deux techniques peuvent être mises en oeuvre sur un microscope à fluorescence à deux photons et ne nécessitent qu'un seul faisceau laser. Cependant, ils nécessitent l'intensité du laser de puissance élevée (typiquement 50mW à 860 nm pour SHG 10, 25 – 50 mW à 1180 nm pour THG 9), qui est délétère dans des échantillons de vie, et ne fournit pas la spécificité chimique qui est nécessaire pour clairement l' image de structures biologiques spécifiques.
Chimiquement imagerie sélective peut être obtenue à partir des signaux de vibration moléculaire inhérentes basées sur la diffusion Raman. Lorsqu'un faisceau de lumière frappe la matière, les photons peuvent être absorbés et dispersés par des atomes ou des molécules. La plupart des photons diffusés auront la même énergie, à savoir la fréquence, que les photons incidents. Ce processus est appelé diffusion Rayleigh. Cependant, un petit nombre de photons seront dispersées à une fréquence optique différente de la fréquence des photons incidents, à savoir, avec un processus de diffusion inélastique appelé diffusion Raman. La différence d'énergie provient d'une excitation des modes de vibration en fonction de la structure moléculaire et l'environnement. Par conséquent, Raman spontanée diffusion provides d'imagerie chimique sélective des molécules différentes ont des fréquences vibratoires spécifiques. Toutefois, il est limité en raison de son signal extrêmement faible. Confocale microscopie Raman a été développé et fournit une résolution spatiale en 3D, mais il nécessite une puissance moyenne élevée et à long temps d' acquisition 11. Pour surmonter ces difficultés, les progrès récents dans la technologie laser ont permis la montée de la microscopie non linéaire de vibration optique, en particulier la diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS) 11,12,13.
CARS est un processus optique non linéaire du troisième ordre. Trois faisceaux laser, composé d'un faisceau de pompage à la fréquence ω P, un faisceau Stokes à la fréquence ω S et un faisceau de sonde (étant le plus souvent la pompe) sont concentrés dans un échantillon et de générer un faisceau anti-Stokes à la fréquence de AS = ( 2ω P – ω S) 14. Le signal anti-Stokes peut être considérablement améliorée lorsque la différence de fréquenceentre la pompe et les faisceaux de Stokes est accordé à une vibration moléculaire Raman Ω R = (ω P – ω S). le signal CARS est basé sur l'interaction de photons multiples. Il génère donc un ordre de signaux cohérents de grandeur plus forte que la diffusion Raman spontanée.
Microscopie CARS a été démontré expérimentalement par Duncan et al. 15. Zumbusch et al. , Améliore alors la technique, en utilisant deux concentrés dans le proche infrarouge des faisceaux laser femtoseconde avec une lentille d' objectif à grande ouverture numérique, permettant la mise en correspondance l' état de phase de CARS , et en évitant les deux photons non résonante fond 16. Microscopie CARS a donc émergé comme un outil puissant pour l' imagerie cellulaire et les tissus vivants, en détectant chimiquement des molécules telles que les lipides (par vibration CH stretch) 17,18, l' eau (via OH vibrations d'étirement), les protéines, l' ADN dans les cellules vivantes 19,20 mais aussi deutéré composé chimiques pour les produits pharmaceutiques et cosmétiques 21 22.
La principale limitation de la microscopie non linéaire provient de la complexité et le coût des sources optiques. Un système de CARS nécessite deux lasers de longueur d'onde accordables avec de courtes durées d'impulsion et avec des trains d'impulsions temporellement et spatialement synchronisés. Les premiers microscopes CARS reposaient sur deux picoseconde synchronisée Ti: saphir lasers 20. CARS imagerie a également été obtenue à partir d' un seul femtoseconde Ti: laser saphir générer une source de lumière supercontinuum 23. Récemment, des sources laser composées d'un seul femtoseconde Ti: laser saphir pompage d'un oscillateur paramétrique optique accordable (OPO) ont été utilisés pour la microscopie CARS. Cette configuration permet intrinsèquement temporellement synchronisée des faisceaux avec une différence de fréquence entre la pompe et le faisceau Stokes couvrant le spectre de vibration moléculaire complète 24. En outre, les microscopes à balayage laser basé sur un chiffre d'affaireslaser touche fs et une OPO, principalement utilisé pour la fluorescence à deux photons (TPF) sont maintenant disponibles pour les non-physiciens. Le potentiel de ces set-up peut être grandement améliorée sans nécessiter des investissements supplémentaires par l'incorporation d'autres techniques d'imagerie optique non linéaire, puisque chaque non linéaire (NLO) modalité d'imagerie est sensible à des structures ou des molécules spécifiques. Imagerie multimodaux NLO capitalise donc le potentiel de NLO microscopie pour des échantillons biologiques complexes 25. Le couplage de ces techniques a permis à l'enquête sur de nombreuses questions biologiques, en particulier sur le métabolisme des lipides, la peau ou le cancer du développement 26, le développement du muscle squelettique 27, les lésions athéroscléreuses 28. En outre, la mise en œuvre de balayage par faisceau laser avec CARS donne la capacité d'imagerie à haut débit, à savoir, un outil attrayant pour étudier les processus dynamiques in vivo.
Le but de ce travail est de montrer chaque étape pour mettre en œuvre ttechnique il CARS sur un microscope à balayage laser multiphotonique standard. Le microscope est basé sur un alliage Ti fs: laser à saphir et un OPO (pompé par le Ti: saphir laser) commandé par un logiciel pour les biologistes. L'intégration a été réalisée en ajustant la longueur de l'une de la trajectoire du faisceau laser afin de synchroniser dans le temps les deux faisceaux. Nous décrivons la mise en oeuvre étape par étape de cette technique qui ne nécessite qu'une formation de base en optique expérimentale. Nous illustrons également CARS imagerie obtenus sur les gaines de myéline du nerf sciatique des rongeurs, et nous montrons cette imagerie peut être réalisée simultanément avec d'autres imagerie optique non linéaire, comme technique de fluorescence à deux photons standard et la deuxième génération de l'harmonique.
La partie la plus difficile du travail est la synchronisation temporelle des faisceaux laser. Elle exige une photodiode rapide combiné avec un oscilloscope rapide, mais seulement un chevauchement rugueux dans le temps peut être réalisée dans un premier temps. Ensuite, un ajustement supplémentaire de quelques cm est nécessaire. Enfin, micromètre se déplace d'une platine de translation linéaire permet d'effectuer le réglage fin final de la longueur de la ligne de retard afin de déclencher le signal CARS…
The authors have nothing to disclose.
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
Motorized periscope | Newport | ||
Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
Beam combiner | Carl Zeiss | ||
Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
ZEN software | Carl Zeiss | ||
Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |