יישום של מערכת קוהרנטית אנטי סטוקס פיזור ראמאן (CARS) על טי: ספיר OPO לייזר מבוסס תקן לייזר מיקרוסקופ סריקה
Summary
קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן פיזור (CARS) מיקרוסקופיה מבוסס על רטט טבוע של אג"ח מולקולה התיר ללא תווית כימי סלקטיבית הדמית תא חייה. עבודה זו מציגה יישום טכניקה מיקרוסקופיה משלימים על מיקרוסקופ סריקת לייזר multiphoton התקן על בסיס Ti femtosecond: לייזר ספיר לייזר OPO.
Abstract
מיקרוסקופים סריקת לייזר המשלב femtosecond Ti: לייזר ספיר מתנד פרמטרי אופטי (OPO) לשכפל קו לייזר נהיו זמינים ביולוגים. מערכות אלה נועדו בעיקר עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי שני פוטונים רב ערוצית. עם זאת, ללא כל שינוי, מיקרוסקופיה אופטית שאינו ליניארי משלימה כגון דור השני הרמוני (SHG) או דור הרמוני שלישי (THG) יכולה גם להתבצע עם הסט-אפ הזה, המאפשר הדמיה ללא תווית של מולקולות מובנהיות או בינוני מימי ממשקי שומנים. טכניקות אלו מתאימות גם אותו להסתכלות-vivo, אבל מוגבלות וספציפי כימיים. מבחינה כימית הדמיה סלקטיבית ניתן לקבל אותות הרטט הגלום מבוסס על פיזור ראמאן. מיקרוסקופיה Confocal ראמאן מספקת רזולוצית מרחבית 3D, אבל זה דורש הספק ממוצע גבוה וזמן רכישה ארוך. כדי להתגבר על קשיים אלה, ההתקדמות בטכנולוגיית לייזר התירו development של מיקרוסקופיה רטט הקוית האופטית, ב אנטי סטוקס ראמאן קוהרנטי במיוחד פיזור (CARS). מיקרוסקופיה CARS ולכן התפתחה ככלי רב עצמה עבור הדמית תא ביולוגית חייה, על ידי שומני מיפוי כימי (באמצעות רטט למתוח CH), מים (באמצעות תנודות מתיחת OH), חלבונים או דנ"א. בעבודה זו, אנו מתארים את יישום הטכניקה CARS על מיקרוסקופ סריקת לייזר multiphoton תקן מצמידים OPO. היא מבוססת על סנכרון בזמן של שני קווי לייזר על ידי התאמת אורך אחד בנתיב קרן לייזר. אנו מציגים יישום צעד-אחר-צעד של טכניקה זו על מערכת multiphoton קיימת. רקע בסיסי באופטיקה ניסיונית הוא מסייע למערכת המוצגת אינה דורשת ציוד משלים יקר. כמו כן, אנו ממחישים CARS הדמיה מתקבל על נדני המיאלין של עצב השת של מכרסמים, ואנו מראים כי הדמיה זו יכולה להתבצע בו זמנית עם הדמיה אופטית לא לינארית אחר, כגון t הסטנדרטיוו-פוטון טכניקת קרינה ואת הדור השני-הרמוני.
Introduction
מיקרוסקופיה אופטית הפכה טכניקה גדולה להדמיה הורסת של תהליכים דינמיים חיים במערכות ביולוגיות עם רזולוצית subcellular. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא כיום בניגוד ההדמיה הנפוץ ביותר בשימוש בתאי חיים בשל סגולי והרגישות 1 הגבוהים שלה. לוח צבעים גדול של בדיקות ניאון התפתח (צבעי אקסוגניים, חלבונים מקודדים גנטי, חלקיקים מוליכים למחצה). טכניקות פלורסנט מבוסס תאורת מדגם שונות פרחו (כגון מיקרוסקופיה confocal או שני פוטונים) לבצע הדמית 3D וכדי להפחית חסרון עיקרי של שיטה זו אשר photobleaching 2. מגבלות נוספות כוללות את הדרישה של תיוג fluorophore כי רוב המינים מולקולריים אינם פלורסנט מהותי ולכן fluorophores אלה צריכים להיות מוצגים באופן מלאכותי במדגם צלם. מניפולציה מלאכותית זו עלולה להיות הרסנית במיוחד עבור מולקולות קטנות או גורם סירצילום רעיל ential. סיבות אלו הופכות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לא מתאים לתצפיות ב- vivo. לפיכך, השימוש בטכניקות הדמיה אופטיות עם רגישות גבוהה וניגודים מולקולריים מסוימים ללא השימוש של מולקולות ניאון רצוי מאוד במדע הביו-רפואי.
כמה שיטות הדמיה קויות אופטיות ללא תיוג או מכתים צמחו, כולל 5 השני-הרמוני דור (SHG) 3,4 ושלישי-הרמוני דור (THG). מיקרוסקופיה SHG נעשתה שימוש כדי הסדרים מבניים תמונה ברמה המולקולרית כגון microtubules או קולגן 6. THG מופק heterogeneities האופטי כגון ממשק בין 7 בינוני ושומנים מימיים. THG גם הודגם המיאלין תמונה 8,9. יכול להיות מיושם הן טכניקות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי שני הפוטונים ודורשים רק קרן לייזר אחת. עם זאת הם דורשים עוצמת הלייזר בהספק גבוה (בדרך כלל 50mW ב 860 ננומטר במשך 10 SHG, 25 – 50 מגה ואט עם 1,180 ננומטר עבור 9 THG), המהווה מזיק בדגימות חיים, ואינו מספק את הספציפיות הכימיות כי נדרשה מבנים ביולוגיים ספציפיים באופן חד משמע תמונה.
מבחינה כימית הדמיה סלקטיבית ניתן לקבל אותות הרטט מולקולרי הגלום מבוסס על פיזור ראמאן. כאשר קרן אור פוגעת משנה, פוטונים יכולים להיספג מפוזרים על ידי אטומים או מולקולות. רוב הפוטונים המפוזרים תהיה אותה האנרגיה, כלומר, תדר, כמו פוטוני האירוע. תהליך זה נקרא פיזור ריילי. עם זאת, מספר קטן של פוטונים יהיה מפוזר בתדירות אופטית שונה מהתדירות של פוטוני האירוע, כלומר, עם תהליך פיזור קשיח נקרא פיזור ראמאן. ההבדל באנרגיה שמקורה העירור של אופני תנודה תלויים במבנה מולקולרי סביבה. לכן, ראמאן ספונטנית prov פיזוראידו הדמיה סלקטיבית כימי כמו יש מולקולות שונות תדרי רטט ספציפיים. עם זאת, הוא מוגבל בשל האות החלשה מאוד שלה. מיקרוסקופיה Confocal ראמאן פותחה ומספקת רזולוצית מרחבית 3D, אבל זה דורש רכישת כוח וארוכה ממוצעים הגיע זמן 11. כדי להתגבר על קשיים אלה, ההתקדמות בטכנולוגיית לייזר אפשרו עלייה של מיקרוסקופיה הרטט אופטית לא לינארית, ב פיזור אנטי סטוקס ראמאן קוהרנטי מסוים (CARS) 11,12,13.
CARS הוא תהליך אופטי לא לינארית מסדר שלישי. שלוש קרנות ליזר, מורכב קרן משאבה בתדר ω P, קרן סטוקס בתדר ω S וקרן בדיקה (לרוב להיות המשאבה) מתמקדות בדגימה וליצור קרן אנטי סטוקס בתדר ω AS = ( 2ω P – ω S) 14. האות אנטי סטוקס ניתן לשפר באופן משמעותי כאשר ההבדל התדירבין המשאבה לבין סטוקס הקורות והוא מכוון R Ω הרטט המולקולרי ראמאן = (ω P – ω S). אות CARS מבוססת על אינטראקצית פוטון מרובה. זה יוצר אפוא הזמנות אות קוהרנטית גודל חזק יותר פיזור ראמאן ספונטני.
מיקרוסקופיה CARS הוצגה לראשונה באופן ניסיוני על ידי דאנקן et al. 15. Zumbusch et al. השתפר אז הטכניקה, באמצעות שתי אלומות לייזר femtosecond ממוקד האינפרה-אדום הקרוב עם עדשה אובייקטיבי של הצמצם המספרי גבוה, מה שמאפשר את המצב התאמת שלב של מכוניות הימנעות רקע שני הפוטונים שאינם התהודה 16. מיקרוסקופיה CARS ולכן התפתחה ככלי רב עוצמה עבור הדמיה תא ורקמות חיים, על ידי איתור מולקולות כימית כגון שומנים (באמצעות רטט למתוח CH) 17,18, מים (דרך למתוח OH ויברציות), חלבונים, DNA בתאים חיים 19,20 אבל גם deuterated תרכובת כימיתים עבור תרופות 21 יישומים קוסמטיים 22.
המגבלה העיקרית של מיקרוסקופיה הקוית מקורו המורכב ואת עלות המקורות האופטיים. מערכת CARS דורשת שני לייזרים מתכווננים גל עם משכי דופק קצרים ועם temporally מרחבית רכבות דופקות מסונכרנים. מיקרוסקופים CARS מוקדם התבססו על שני מסונכרן picosecond Ti: לייזרים ספיר 20. CARS הדמיה גם התקבל Ti femtosecond יחיד: לייזר ספיר יצירת מקור אור supercontinuum 23. לאחרונה, מקורות לייזר מורכב יחיד femtosecond Ti: לייזר ספיר שאיבה מתנדים פרמטרית אופטיים מתכונן (OPO) שימשו במשך מיקרוסקופיה CARS. הגדרה זו מאפשרת קורות מסונכרנים באופן זמני מעצם מהותו עם הבדל של תדירויות בין המשאבה לבין קרן סטוקס מכסה ספקטרום התדר המולקולרי המלא 24. בנוסף, מיקרוסקופים סריקת לייזר המבוסס על מודעות מראשיתליזר FS מפתח וכן OPO, המשמש בעיקר קרינת שני פוטונים (TPF) זמינים כעת עבור-פיסיקאים שאינם. הפוטנציאל של סט-אפ כזה יכול להיות מאוד משופר ללא צורך בהשקעה הנוספת על ידי שילוב של הדמיה אופטית לא לינארית שני, מאחר ולכל שיטת הדמיה קוי (NLO) הוא רגיש מבנים או מולקולות ספציפיות. הדמית NLO מולטימודליות ולכן מהוונת את הפוטנציאל של מיקרוסקופיה NLO עבור דגימות ביולוגיות מורכבות 25. הצימוד של טכניקות אלה אפשר את חקירת שאלות ביולוגיות רבות, בפרט על מטבוליזם שומנים, פיתוח עור או סרטן 26, פיתוח שרירי שלד 27, טרשת עורקת 28. יתר על כן, יישום סריקת קרן ליזר עם מכוניות נותן את היכולת של הדמיה גבוה שיעור, כלומר, כלי מושך ללמוד תהליכים דינמיים in vivo.
מטרת עבודה זו היא להראות כל צעד ליישם tCARS הוא טכניקה על מיקרוסקופ סריקת לייזר multiphoton סטנדרטי. המיקרוסקופ מבוסס על fsec Ti: לייזר ספיר וכן OPO (שאוב על ידי Ti: ספיר לייזר) מופעל על ידי תוכנה עבור ביולוגים. השילוב בוצע על ידי התאמת אורך אחד בנתיב קרן לייזר על מנת לסנכרן בזמן שתי הקורות. אנו מתארים את השלב-אחר-צעד ליישום הטכניקה הזו מחייב רקע בסיסי בלבד באופטיקה ניסיון. כמו כן, אנו ממחישים CARS ההדמיה מתקבלים על נדני המיאלין של עצב השת של מכרסמים, ואנחנו מראים הדמיה זו יכולה להתבצע בו זמנית עם הדמיה אופטית לא לינארית אחר, כגון טכניקת קרינת שני פוטונים סטנדרטיים דור שני-הרמוני.
Protocol
Representative Results
Discussion
החלק המאתגר ביותר של העבודה הוא סנכרון הזמני של קרני לייזר. זה דורש פוטודיודה מהיר בשילוב עם אוסצילוסקופ מהר, אבל רק חופפים גסים בזמן יכולים להתבצע בהתחלה. ואז התאמה נוספת של כמה ס"מ נדרש. לבסוף, מהלכי מיקרומטר ידי במת תרגום ליניארי מאפשרים ביצוע ההתאמה בסדר הסופי ש…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
Riferimenti
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. . Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
- Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
- Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
- Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
- Mukamel, S. . Principles of nonlinear optical spectroscopy. , (1995).
- Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
- Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
- Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -. B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
- Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
- Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106 (2011).
- Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
- Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).
- Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
- Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007 (2007).
- Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O’Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
- Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
- Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
- Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
- King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
- Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
- Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
- Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).
