नीलम और OPO लेजर आधारित मानक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप: तिवारी पर एक सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन प्रकीर्णन (कार) प्रणाली के कार्यान्वयन
Summary
सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन बिखरने (कार) अणु बांड के निहित कंपन के आधार पर माइक्रोस्कोपी लेबल मुक्त रासायनिक चयनात्मक लाइव सेल इमेजिंग परमिट। नीलमणि लेजर और एक OPO लेजर: यह काम एक femtosecond तिवारी के आधार पर एक मानक multiphoton लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर एक पूरक माइक्रोस्कोपी तकनीक के कार्यान्वयन प्रस्तुत करता है।
Abstract
एक femtosecond तिवारी के संयोजन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप: नीलम लेजर और एक ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला (OPO) लेजर लाइन नकल करने जीव के लिए उपलब्ध हो गए हैं। इन प्रणालियों मुख्य रूप से मल्टी चैनल दो photon प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार कर रहे हैं। हालांकि, किसी भी संशोधन के बिना, इस तरह की दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) या तीसरे हार्मोनिक पीढ़ी (THG) के रूप में पूरक गैर रेखीय ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी भी इस सेट अप के साथ, की अनुमति संरचित अणुओं या जलीय मध्यम का लेबल मुक्त इमेजिंग किया जा सकता है लिपिड इंटरफेस। इन तकनीकों में अच्छी तरह से इन विवो अवलोकन के लिए अनुकूल हैं, लेकिन रासायनिक विशिष्टता में सीमित कर रहे हैं। रासायनिक चयनात्मक इमेजिंग निहित कंपन रमन बिखरने पर आधारित संकेतों से प्राप्त किया जा सकता है। Confocal रमन माइक्रोस्कोपी 3 डी स्थानिक संकल्प प्रदान करता है, लेकिन यह उच्च औसत शक्ति और लंबे समय के अधिग्रहण के समय की आवश्यकता है। इन कठिनाइयों को दूर करने के लिए, लेजर प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों गतिविधियों की अनुमति दी हैnonlinear ऑप्टिकल कंपन माइक्रोस्कोपी के opment, विशेष रूप से सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन में (कार) बिखरने। कारों माइक्रोस्कोपी इसलिए, जैविक और लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है रासायनिक मानचित्रण लिपिड (सीएच खिंचाव कंपन के माध्यम से), पानी (ओएच खिंचाव कंपन के माध्यम से), प्रोटीन या डीएनए से। इस काम में, हम एक मानक OPO युग्मित multiphoton लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर कारों तकनीक के कार्यान्वयन का वर्णन है। यह समय में लेजर किरण पथ में से एक की लंबाई का समायोजन करके दो लेजर लाइनों के तुल्यकालन पर आधारित है। हम एक मौजूदा multiphoton सिस्टम पर इस तकनीक का एक कदम-दर-कदम कार्यान्वयन प्रस्तुत करते हैं। प्रयोगात्मक प्रकाशिकी में एक बुनियादी पृष्ठभूमि मददगार है और प्रस्तुत प्रणाली महंगा अनुपूरक उपकरण की आवश्यकता नहीं है। हम भी इमेजिंग कारों कृंतक की sciatic तंत्रिका की मेलिन शीथ पर प्राप्त उदाहरण देकर स्पष्ट करना, और हम बताते हैं कि इस तरह के मानक इमेजिंग टी के रूप में अन्य nonlinear ऑप्टिकल इमेजिंग, के साथ एक साथ किया जा सकता हैwo फोटॉन प्रतिदीप्ति तकनीक और दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी।
Introduction
ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी एक subcellular संकल्प के साथ जैविक प्रणालियों जीने में गतिशील प्रक्रियाओं का nondestructive दृश्य के लिए एक प्रमुख तकनीक बन गया है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी वर्तमान में अपने उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता 1 के कारण सबसे लोकप्रिय इमेजिंग जीवित कोशिकाओं में इस्तेमाल विपरीत है। फ्लोरोसेंट जांच की एक बड़ी पैलेट (बहिर्जात रंजक, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग प्रोटीन, अर्धचालक नैनोकणों) में उभरा है। विभिन्न नमूना रोशनी फ्लोरोसेंट आधारित तकनीक (जैसे confocal या दो photon माइक्रोस्कोपी के रूप में) 3 डी इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए और इस तकनीक जो 2 photobleaching है की एक मुख्य दोष को कम करने के लिए निखरा है। अन्य सीमाओं fluorophore लेबलिंग की आवश्यकता शामिल हैं क्योंकि आणविक प्रजातियों में से सबसे आंतरिक रूप से फ्लोरोसेंट नहीं हैं और इसलिए इन fluorophores कृत्रिम रूप से imaged नमूना में पेश किया जाना है। इस कृत्रिम हेरफेर छोटे अणुओं के लिए विशेष रूप से हानिकारक हो या बर्तन लाती सकता हैential तस्वीर विषाक्तता। इन कारणों से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी नहीं अच्छी तरह से इन विवो टिप्पणियों के लिए अनुकूल बनाते हैं। इसलिए, फ्लोरोसेंट अणु के उपयोग के बिना उच्च संवेदनशीलता और विशिष्ट आणविक विरोधाभासों के साथ ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के उपयोग के जैव चिकित्सा विज्ञान के क्षेत्र में अत्यधिक वांछनीय है।
लेबलिंग या धुंधला बिना कई nonlinear ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) 3,4 और तीसरे हार्मोनिक पीढ़ी (THG) 5 सहित उभरा है। एसएचजी माइक्रोस्कोपी ऐसे सूक्ष्मनलिकाएं या कोलेजन के रूप में 6 supramolecular स्तर पर छवि संरचनात्मक व्यवस्था करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। THG इस तरह के एक जलीय मध्यम और लिपिड 7 के बीच इंटरफेस के रूप में ऑप्टिकल विषमताओं से उत्पन्न होता है। THG भी छवि माइलिन 8,9 करने के लिए प्रदर्शन किया गया। दोनों तकनीकों एक दो photon प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर लागू किया जा सकता है और केवल एक लेजर बीम की आवश्यकता होती है। हालांकि वे उच्च शक्ति लेजर तीव्रता की आवश्यकता होती है (आमतौर पर 50स्वयं सहायता समूह के 10, 25 के लिए 860 एनएम पर मेगावाट – 50 मेगावाट THG 9 के लिए 1,180 एनएम) है, जो रहने वाले नमूनों में हानिकारक है, और रासायनिक विशिष्टता है कि स्पष्ट छवि के विशिष्ट जैविक संरचनाओं के लिए आवश्यक है प्रदान नहीं करते पर।
रासायनिक चयनात्मक इमेजिंग निहित आणविक कंपन रमन बिखरने पर आधारित संकेतों से प्राप्त किया जा सकता है। प्रकाश की एक किरण बात हिट, फोटॉनों अवशोषित और परमाणुओं या अणुओं से तितर-बितर हो सकते हैं। बिखरे हुए फोटॉनों के अधिकांश घटना फोटॉनों के रूप में ही ऊर्जा, यानी, आवृत्ति, होगा। इस प्रक्रिया के रेले बिखरने कहा जाता है। हालांकि, फोटॉनों की एक छोटी संख्या एक स्थिर बिखरने प्रक्रिया रमन बिखरने कहा जाता है, के साथ एक ऑप्टिकल आवृत्ति घटना फोटॉनों, यानी की आवृत्ति से अलग पर बिखर जाएगा। ऊर्जा के क्षेत्र में अंतर आणविक संरचना और वातावरण पर निर्भर करता कंपन मोड की उत्तेजना से निकलती है। इसलिए, सहज रमन बिखरने नीतिइडस रासायनिक चयनात्मक इमेजिंग के रूप में विभिन्न अणुओं विशिष्ट कंपन आवृत्तियों की है। हालांकि यह अपने बेहद कमजोर संकेत की वजह से सीमित है। Confocal रमन माइक्रोस्कोपी विकसित किया गया है और 3 डी स्थानिक संकल्प प्रदान करता है, लेकिन यह उच्च औसत शक्ति और लंबे समय के अधिग्रहण के समय 11 की आवश्यकता है। इन कठिनाइयों को दूर करने के लिए, लेजर प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों nonlinear ऑप्टिकल कंपन माइक्रोस्कोपी का उदय, विशेष रूप से सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन बिखरने में (कार) 11,12,13 की अनुमति दी है।
कारों एक तीसरे क्रम nonlinear ऑप्टिकल प्रक्रिया है। तीन लेजर बीम, आवृत्ति ω पी पर एक पंप बीम से बना है, आवृत्ति ω एस पर एक स्टोक्स बीम और एक जांच किरण (सबसे अधिक बार पंप किया जा रहा है) एक नमूने में केंद्रित है और (आवृत्ति ω के रूप में = पर एक विरोधी स्टोक्स किरण उत्पन्न कर रहे हैं 2ω पी – ω एस) 14। विरोधी स्टोक्स संकेत काफी बढ़ाया जा सकता है जब आवृत्ति अंतर(- ω एस ω पी) पंप और स्टोक्स मुस्कराते हुए एक रमन आणविक कंपन Ω आर = को देखते है के बीच। कारों संकेत कई फोटोन बातचीत पर आधारित है। इसलिए यह परिमाण सहज रमन बिखरने की तुलना में मजबूत के एक सुसंगत संकेत के आदेश उत्पन्न करता है।
कारों माइक्रोस्कोपी पहले प्रयोगात्मक डंकन एट अल। 15 द्वारा प्रदर्शन किया गया। Zumbusch एट अल। तो तकनीक में सुधार, उच्च संख्यात्मक एपर्चर का एक उद्देश्य लेंस के साथ दो केंद्रित लगभग अवरक्त femtosecond लेजर बीम का उपयोग कर कारों के चरण मिलान हालत अनुमति देता है और दो photon न सुनाई देती पृष्ठभूमि 16 से बचने के द्वारा। कारों माइक्रोस्कोपी इसलिए, जीना सेल और ऊतकों इमेजिंग के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है रासायनिक जीवित कोशिकाओं 19,20 में इस तरह के लिपिड के रूप में अणुओं (सीएच खिंचाव कंपन के माध्यम से) 17,18, पानी (ओएच खिंचाव कंपन के माध्यम से), प्रोटीन, डीएनए का पता लगाने के द्वारा लेकिन यह भी रासायनिक यौगिक deuteratedदवा 21 और कॉस्मेटिक अनुप्रयोगों 22 के लिए है।
nonlinear माइक्रोस्कोपी के प्रमुख सीमा जटिलता और ऑप्टिकल स्रोतों की लागत से निकलती है। एक कार प्रणाली छोटी नाड़ी durations के साथ और अस्थायी और स्थानिक सिंक्रनाइज़ नाड़ी गाड़ियों के साथ दो तरंगदैर्ध्य ट्यून करने योग्य लेज़रों की आवश्यकता है। जल्दी कारों सूक्ष्मदर्शी दो सिंक्रनाइज़ पीकोसैकन्ड तिवारी पर आधारित थे: नीलम लेज़रों 20। नीलमणि लेजर एक supercontinuum प्रकाश स्रोत 23 पैदा: कारों इमेजिंग भी एक femtosecond तिवारी से प्राप्त हुई थी। हाल ही में, एक भी femtosecond तिवारी की रचना की लेजर सूत्रों: नीलम लेजर एक tunable ऑप्टिकल पैरामीट्रिक oscillators (OPO) से पंप कारों माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह सेट-अप आंतरिक रूप से अस्थायी पंप और पूर्ण आणविक कंपन स्पेक्ट्रम को कवर 24 स्टोक्स बीम के बीच आवृत्ति की एक अंतर के साथ मुस्कराते हुए सिंक्रनाइज़ की अनुमति देता है। इसके अलावा, एक turn- के आधार पर लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपकुंजी FS लेजर और एक OPO, मुख्य रूप से दो photon प्रतिदीप्ति (TPF) के लिए इस्तेमाल अब गैर भौतिक विज्ञानियों के लिए उपलब्ध हैं। इस तरह के सेट-अप की क्षमता बहुत अन्य nonlinear ऑप्टिकल इमेजिंग के समावेश से पूरक निवेश की आवश्यकता के बिना बढ़ाया जा सकता है के बाद से प्रत्येक nonlinear (एनएलओ) इमेजिंग साधन विशिष्ट संरचना या अणुओं के प्रति संवेदनशील है। मल्टीमॉडल एनएलओ इमेजिंग इसलिए जटिल जैविक नमूने 25 एनएलओ माइक्रोस्कोपी के संभावित capitalizes। इन तकनीकों के युग्मन लिपिड चयापचय, त्वचा या कैंसर के विकास 26, कंकाल की मांसपेशी विकास 27, atherosclerotic घावों 28 पर कई जैविक सवालों की जांच की अनुमति दी है, विशेष रूप से। इसके अलावा, कारों के साथ लेजर बीम स्कैनिंग के कार्यान्वयन के उच्च दर इमेजिंग, यानी, विवो में dynamical प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अपील उपकरण की क्षमता देता है।
इस काम का उद्देश्य टी को लागू करने के लिए हर कदम को दिखाने के लिए हैएक मानक multiphoton लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर वह कारों तकनीक। माइक्रोस्कोप एक FSEC तिवारी पर आधारित है: नीलम लेजर और एक OPO (तिवारी द्वारा पंप: नीलम लेजर) जीव के लिए एक सॉफ्टवेयर द्वारा संचालित है। एकीकरण के क्रम में समय में दो मुस्कराते हुए सिंक्रनाइज़ करने में लेजर किरण पथ में से एक की लंबाई का समायोजन करके प्रदर्शन किया गया था। हम कदम-दर-कदम इस तकनीक है जो प्रयोगात्मक प्रकाशिकी में केवल बुनियादी पृष्ठभूमि की आवश्यकता के कार्यान्वयन का वर्णन है। हम भी उदाहरण देकर स्पष्ट कारों कृन्तकों के sciatic तंत्रिका की मेलिन शीथ पर प्राप्त इमेजिंग, और हम बताते हैं इस इमेजिंग इस तरह के मानक दो photon प्रतिदीप्ति तकनीक और दूसरे हार्मोनिक पीढ़ी के रूप में, अन्य nonlinear ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ एक साथ किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
काम की सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा लेजर बीम के अस्थायी तुल्यकालन है। यह एक तेजी से एक तेजी से आस्टसीलस्कप के साथ संयुक्त photodiode आवश्यकता है, लेकिन कुछ ही समय में किसी न किसी ओवरलैपिंग पहली बार में किया जा सकत?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
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