サファイアとOPOレーザー基づく標準レーザー走査顕微鏡：Tiの上のコヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）システムの実装
Summary
分子結合の固有振動に基づくコヒーレント反ストークスラマン散乱（CARS）顕微鏡検査は、ラベルフリー化学的選択のライブセルイメージングを可能にします。サファイアレーザとOPOレーザー：この作品は、フェムト秒チタンに基づく標準的な多光子レーザー走査顕微鏡上の相補的な顕微鏡技術の実装を提供します。
Abstract
フェムト秒チタンを組み合わせたレーザー走査型顕微鏡：サファイアレーザと光パラメトリック発振器（OPO）レーザーラインを複製するには、生物学者のために利用できるようになりました。これらのシステムは、主に、マルチチャンネル二光子蛍光顕微鏡用に設計されています。しかし、そのまま、このような第二高調波発生（SHG）や第3高調波発生（THG）などの補完的な非線形光学顕微鏡は、また、構造化分子または水性中型のラベルフリーイメージングを可能にする、このセットアップを行うことができます脂質インターフェース。これらの技術は、生体内の観察に適しているが、化学的特異性が限られています。化学的に選択的なイメージングは、ラマン散乱に基づく固有振動信号から得ることができます。共焦点ラマン顕微鏡は、3次元空間分解能を提供するが、それは、高平均パワーと長い取得時間を必要とします。これらの困難を克服するために、レーザー技術の最近の進歩は、develのを可能にしました特にコヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）での非線形光学振動顕微鏡の発、。 CARS顕微鏡は、したがって、化学的にマッピング（OH伸縮振動を介して）（CH伸縮振動を介して）、脂質、水、タンパク質やDNAによって、生物学的および生細胞イメージングのための強力なツールとして浮上しています。本研究では、標準的なOPO結合多光子レーザー走査顕微鏡にCARS技術の実装について述べます。これは、レーザビーム経路の一方の長さを調整することによって二つのレーザラインにおける時間同期に基づいています。我々は、既存の多光子システム上でこの技術のステップバイステップの実装を提示します。実験光学系における基本的な背景が有用であると提示システムは高価な補助的な装置を必要としません。我々はまた、げっ歯類の坐骨神経のミエリン鞘に取得したCARSイメージングを示しており、我々はこのイメージングは、標準トンのような他の非線形光学イメージングと同時に行うことができることを示していますWO-光子蛍光技術と第二高調波発生。
Introduction
光学顕微鏡は、細胞内の分解能で生物学的システムを生きているの動的プロセスの非破壊可視化のための主要な技術となっています。蛍光顕微鏡は、その高い特異性と感度1に、現在生きている細胞で使用される最も人気のある画像造影です。蛍光プローブの大きなパレットは（外因性染料、遺伝的にコードされたタンパク質、半導体ナノ粒子）を浮上しています。様々な試料照明蛍光ベースの技術は、3D画像化を実行し、2を光退色されるこの技術の主な欠点を減らすために（例えば、共焦点または二光子顕微鏡法のような）栄えています。分子種の大部分は本質的に蛍光性ではなく、したがって、これらのフルオロフォアは、人為的に撮像された試料に導入しなければならないので、他の制限は、フルオロフォア標識の要件を含みます。この人工的な操作は、小分子のために特に破壊的であるか、または鍋を誘導することができますentialフォト毒性。これらの理由は、生体内の観察のための蛍光顕微鏡ではないに適しています。したがって、蛍光分子を使用することなく、高感度かつ特異的な分子のコントラストを有する光学イメージング技術の使用は、生物医学科学の非常に望ましいです。
標識または染色することなく、いくつかの非線形光学イメージング技術は、第二高調波発生（SHG）3,4と第三高調波発生（THG）5を含む、浮上しています。 SHG顕微鏡は、微小管またはコラーゲン6などの超分子レベルでの画像構造的配置に使用されてきました。 THGは、水性媒体および脂質7との間のインタフェースとしての光不均質から生成されます。 THGは、画像ミエリン8,9に示されました。両方の技術は、二光子蛍光顕微鏡上で実施し、一つのレーザビームを必要とすることができます。しかし、それらは典型的には50（高出力レーザ強度を必要とします生活試料中の有害である、と明確にイメージの特定の生物学的構造をするために必要な化学的特異性を提供しないTHG 9用の1180 nm）を、50 mWの- SHG 10、25用の860 nmのmWの。
化学的に選択的なイメージングは、ラマン散乱に基づいて固有の分子振動信号から得ることができます。光のビームが問題当たると、光子は吸収され、原子または分子によって散乱させることができます。散乱光子のほとんどは、入射光子と同じエネルギー、 すなわち、周波数を、持っています。このプロセスは、レイリー散乱と呼ばれています。しかしながら、光子の少数は、ラマン散乱と呼ばれる非弾性散乱過程で、すなわち、入射光子の周波数とは異なる光周波数で散乱されます。エネルギー差は、分子構造や環境に応じて振動モードの励起に由来します。したがって、自発ラマン散乱プロブIDEの化学選択的イメージングは、異なる分子は、特定の振動周波数を持っています。しかしそれは、その微弱な信号の限られています。共焦点ラマン顕微鏡を開発し、3次元空間分解能を提供するが、それは、高平均パワーと長い取得時間11を必要とされています。これらの困難を克服するために、レーザー技術の最近の進歩は、特に、コヒーレントアンチストークスラマン散乱における非線形光学振動顕微鏡の上昇、（CARS）11,12,13可能にしています。
CARS三次の非線形光学過程です。周波数ωPでポンプビームからなる3つのレーザビームは、周波数ωSのストークスビームおよびプローブビームが（ほとんどの場合、ポンプある）試料に集束され、（周波数ωAS =において反ストークスビームを生成します2ωP – ωS）14。反ストークス信号を大幅に向上させることができる場合の周波数差（ – ωSωP）ポンプおよびストークスビーム間のラマン分子振動のΩのR =に同調されます。 CARS信号は、多光子相互作用に基づいています。したがって、自発ラマン散乱よりも強い大きさのコヒーレント信号の注文を生成します。
CARS顕微鏡法は、第一の実験ダンカンら 15によって示されました。ツンブッシュらは 、高開口数の対物レンズを有する2つの焦点を合わせ、近赤外フェムト秒レーザー光を用いたCARSの位相整合条件を可能にし、二光子非共鳴バックグラウンド16を回避することによって、その後の技術を向上させます。 CARS顕微鏡は、したがって、化学的に、このような生細胞中（OH伸縮振動を介して）（CH伸縮振動を介して）脂質17,18、水、タンパク質、DNA 19,20などの分子を検出することにより、生細胞や組織イメージングのための強力なツールとして浮上していますしかし、化学化合物を重水素化21医薬品及び化粧品用途22のための。
非線形顕微鏡の主な制限は、複雑さと光源のコストに由来します。 CARSシステムは、短いパルス持続時間を持つと時間的および空間的に同期したパルス列を持つ2つの波長可変レーザーを必要とします。初期のCARS顕微鏡は、二つの同期ピコ秒のTiに基づいていた：サファイアレーザー20。スーパコンティニューム光源23を生成するサファイアレーザー：CARSイメージングは、単一のフェムト秒チタンから入手しました。最近では、単一のフェムト秒Tiから成るレーザ光源：波長可変光パラメトリック発振器（OPO）をポンピングサファイアレーザーは、CARS顕微鏡検査のために使用されています。このセットアップは、本質的に時間的にポンプと完全分子の振動スペクトル24を覆うストークスビームの間の周波数の差でビームを同期することを可能にします。また、レーザ走査型顕微鏡ターンに基づきます主に次の2つの光子蛍光（TPF）のために使用されるキーfsレーザとOPOは、非物理学者のために利用できるようになりました。各非線形（NLO）イメージング・モダリティは、特定の構造または分子に敏感であるため、このようなセットアップの可能性が大きく、他の非線形光学イメージングを組み込むことによって補助投資を必要とせずに向上させることができます。マルチモーダルNLOイメージングは、したがって、複雑な生体試料25のためのNLO顕微鏡の可能性を大文字にします。これらの技術の結合は、脂質代謝、皮膚または癌の開発26、骨格筋の発達27、アテローム性動脈硬化病変28に、特に、多くの生物学的な質問の調査を可能にしました。また、CARSのレーザビーム走査の実装は、高速イメージング、 すなわち、 生体内で動的プロセスを研究するための魅力的なツールの能力を与えます。
この作業の目的は、トンを実装するための各ステップを示すことです標準的な多光子レーザー走査型顕微鏡で彼CARS技術。サファイアレーザーとチタン（Tiによってポンプ：サファイアレーザー）OPO：生物学者のためのソフトウェアによって運営顕微鏡は、フェムト秒チタンをベースにしています。積分は、時間的に二つのビームを同期させるために、レーザビーム経路の一方の長さを調整することにより行いました。我々は実験的な光学系における基本的な背景を必要とするこの技術のステップバイステップの実施を説明します。我々はまた、げっ歯類の坐骨神経のミエリン鞘に得られる撮像CARSを示しており、我々はこのイメージングは、標準的な二光子蛍光技術と第二高調波発生などの他の非線形光学イメージングと同時に行うことができる示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
仕事の最も困難な部分は、レーザビームの時間的同期です。これは、高速オシロスコープと組み合わせた高速フォトダイオードを必要としますが、時間の唯一のラフな重なりが最初に行うことができます。その後、数cmのさらなる調整が必要です。最後に、リニア並進ステージによってマイクロメートル移動するCARS信号をトリガするために、遅延線の長さの最終的な微調整を行うことができ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
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