Coherent dispersione anti-Stokes Raman (CARS) microscopia a base di vibrazione intrinseca di obbligazioni molecola permette chimicamente selettivo imaging cellulare dal vivo senza etichetta. Questo lavoro presenta l'implementazione di una tecnica di microscopia complementare su un microscopio a scansione laser multifotone standard basato su un femtosecondi laser Ti: zaffiro ed un laser OPO.
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Articolo metodologico
Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La scansione laser microscopi conciliano un femtosecondi laser Ti: zaffiro e un ottica oscillatore parametrico (OPO) per duplicare la linea laser si sono resi disponibili per i biologi. Questi sistemi sono progettati principalmente per microscopia di fluorescenza a due fotoni multicanale. Tuttavia, senza alcuna modifica, complementare microscopia ottica non lineare come seconda armonica generazione (SHG) o terza generazione armonica (THG) può essere eseguita anche con questo set-up, permettendo l'imaging libera-label di molecole strutturate o medio acquosa interfacce di lipidi. Queste tecniche sono adatti per l'osservazione in vivo, ma sono limitate in specificità chimica. Chimicamente immagini selettiva può essere ottenuta da segnali di vibrazione intrinseche basate su Raman. Confocale microscopia Raman fornisce una risoluzione spaziale in 3D, ma richiede elevata potenza media e tempo di acquisizione a lungo. Per superare queste difficoltà, i recenti progressi nella tecnologia laser hanno permesso lo sviluppo della microscopia vibrazionale ottica non lineare, in particolare coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS). CARS microscopia ha quindi emerso come un potente strumento per l'imaging cellulare biologica e dal vivo, da lipidi chimicamente mappatura (attraverso la vibrazione CH tratto), acqua (attraverso OH tratto vibrazioni), proteine o DNA. In questo lavoro, si descrive l'applicazione della tecnica di automobili su un microscopio a scansione laser multifotonica OPO-accoppiato di serie. Essa si basa sulla sincronizzazione nel tempo delle due linee laser regolando la lunghezza di uno dei percorso del raggio laser. Presentiamo un'implementazione passo-passo di questa tecnica su un sistema multiphoton esistente. Un fondo di base ottica sperimentale è disponibile e il sistema presentato non richiede attrezzature supplementari costose. Illustriamo anche CARS di imaging ottenuti su guaine mieliniche del nervo sciatico di roditori, e dimostriamo che questa immagini può essere eseguito simultaneamente con altri imaging ottico non lineare, come ad esempio t di seriewo-photon tecnica a fluorescenza e la generazione di seconda armonica.
Introduzione
La microscopia ottica è diventata una tecnica importante per la visualizzazione non distruttiva dei processi dinamici nei sistemi biologici viventi con una risoluzione sub-cellulare. Microscopia a fluorescenza è attualmente il contrasto delle immagini più popolare usato in cellule vive per la sua elevata specificità e sensibilità 1. Una grande tavolozza di sonde fluorescenti è emerso (coloranti esogeni, proteine geneticamente codificate, nanoparticelle di semiconduttori). Varie tecniche fluorescenti a base di illuminazione del campione sono fiorite (ad esempio la microscopia confocale o due fotoni) per eseguire l'imaging 3D e ridurre un inconveniente....
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Protocollo
Figura 1. Rappresentazione schematica del set-up generale Include il Ti:. Zaffiro (680 - 1.080 nm) e la OPO (1.050 - 1.300 nm) laser, la linea di ritardo con i 4 specchi (M 1 a M 4), l'oscilloscopio veloce, il fotodiodo e due diaframma fisso diaframmi I 1 e I 2. Specchi M 2 e M 3 sono fissati su un palco traslazione lineare permette di modificare la lunghezza della linea di ritardo con risoluzione micrometrica. A 660 -. Filtro ....
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Risultati
La frequenza treno di impulsi di Ti di serie: laser zaffiro è tipicamente intorno a 80 MHz. Il OPO ha la stessa frequenza in quanto è pompato dal Ti: zaffiro laser. è pertanto necessario un oscilloscopio veloce di almeno 200 MHz. Un fotodiodo veloce nella gamma è richiesta anche 600 a 1.100 nm. Lo spostamento temporale massima si verifica quando il Ti: zaffiro ed i segnali OPO sono spostati di 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6,2 nanosecondi. Essa corrisponde a un cambiamento di pe.......
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Discussione
La parte più impegnativa del lavoro è la sincronizzazione temporale dei raggi laser. Richiede un fotodiodo veloce combinato con un oscilloscopio veloce, ma solo una sovrapposizione ruvida nel tempo può essere eseguita in un primo momento. Poi è necessario un ulteriore aggiustamento di pochi cm. Infine, micrometro si muove da una fase di traslazione lineare permette di eseguire la regolazione fine definitiva della lunghezza della linea di ritardo al fine di innescare il segnale AUTO. Questo segnale viene mantenuto in un .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, Francia) per il prestito dell'oscilloscopio veloce e ringraziano il sostegno finanziario di Montpellier RIO Imaging (MRI). HR riconosce che ANR concede a France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) e France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) le reti infrastrutturali per sviluppi coerenti dell'imaging Raman. Questo lavoro è stato sostenuto principalmente da una sovvenzione del Consiglio europeo della ricerca (FP7-IDEAS-ERC 311610) e da una sovvenzione INSERM - AVENIR a NT.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Oscilloscopio | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Fotorivelatore | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800 - 1.700 nm |
| Laser Ti:Sapphire Chameleon Ultra Family II | Oscillatore | ||
| OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscopio LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Periscopio motorizzato | Newport | ||
| Obiettivo W Plan-Apochromat 20X/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Modulatore acusto-ottico | Carl Zeiss | ||
| Tubo fotomoltiplicatore | Carl Zeiss | ||
| Software ZEN | Carl Zeiss | ||
| filtri | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400 - 480 nm; 500 - 550 Nm; 465 - 610 nm |
| Specchio dicroico | Carl Zeiss | Lunghezza d'onda di taglio 760 nm | |
| Specchi d'argento | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480 - 20.000 nm, Quantità 4 |
| Stadio di traslazione monoassiale con micrometro standard | Thorlabs | PT1/M | Quantità 1 |
| Breadboard in alluminio | Thorlabs | MB1015/M | Quantità 1 |
| Supporto per specchio | Thorlabs | KMSS/M | Quantità 4 |
| Porta specchio per Ø Ottica da 1" | Thorlabs | MH25 | Quantità 4 |
| diaframmi a iride | Thorlabs | ID8/M | Quantità 3 |
| Scatola protettiva | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantità 1 |
| Pali ottici | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantità 8 (lunghezze a seconda della configurazione) |
| Filtro passa-banda 661 - 690 nm | Semrock | 676/29 nm BrightLine® Quantità | 1 |
| Perline fluorescenti | ThermoFisher | TetraSpeck™ Microsfere fluorescenti Kit | |
| di visualizzazione laser | Scheda di visualizzazione laser IR | Thorlabs | |
| Vetro di sicurezza laser | Newport | LV-F22. P5L07 | |
| Fluoromielina&commercio; Colorazione mielinica fluorescente rossa | ThermoFisher | F34652 |
Riferimenti
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , 2nd Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J.
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Ristampe e permessi
