Внедрение системы Связной Антистоксова комбинационное рассеяние (CARS) на Ti: Sapphire и ОРО лазер на основе стандартного лазерного сканирующего микроскопа
Summary
Когерентная антистоксова комбинационного рассеяния света (КАРС) микроскопии на основе присущей вибрации молекул облигаций позволяет без наклеек химически селективное изображений живых клеток. Эта работа представляет реализацию дополнительного метода микроскопии на стандартной многофотонная лазерного сканирующего микроскопа, основанного на фемтосекундного Ti: сапфирового лазера и лазера ОРО.
Abstract
Лазерное сканирующих микроскопов, сочетающие фемтосекундного титан-сапфирового лазера и оптический параметрический генератор (OPO), чтобы дублировать лазерной линии стали доступны для биологов. Эти системы предназначены в первую очередь для многоканальных двухфотонному флуоресцентной микроскопии. Тем не менее, без каких-либо изменений, дополняют друг друга нелинейна оптическая микроскопия, такие как генерации второй гармоники (ГВГ) или генерации третьей гармоники (THG) также могут быть выполнены с этой установкой, что позволяет без наклеек визуализации структурированных молекул или водной средне- липидные интерфейсы. Эти методы хорошо подходят для наблюдения в естественных условиях, но ограничены в химической специфичности. Химически селективного формирования изображения может быть получена из присущих вибрационных сигналов на основе комбинационного рассеяния. Конфокальной микроскопии комбинационного рассеяния обеспечивает 3D пространственное разрешение, но это требует высокой средней мощности и долгое время приобретения. Для преодоления этих трудностей, последние достижения в области лазерной технологии позволили развитие нелинейной оптической колебательной микроскопии, в частности когерентного антистоксова комбинационного рассеяния света (КАРС). АВТОМОБИЛИ микроскопии поэтому возникла как мощный инструмент для биологического и живого изображения клеток, путем химического картирования липидов (через CH стретч вибрации), воды (через ОН-стретч вибрации), белков или ДНК. В этой работе мы опишем реализацию метода Машинки на стандартной ОРО связью многофотонная лазерного сканирующего микроскопа. Он основан на синхронизации в конкретный момент времени двух лазерных линий путем регулировки длины одного из пути лазерного луча. Мы представляем реализацию шаг за шагом этой методики на существующей системе многофотонном. Основной фон в экспериментальной оптике является полезным и представленная система не требует дорогостоящего дополнительного оборудования. Мы также иллюстрируют АВТОМОБИЛИ формирования изображения, полученные на миелиновых оболочек седалищного нерва грызуна, и мы покажем, что это формирование изображений может выполняться одновременно с другими нелинейной оптической визуализации, такие как стандартные тWO-фотоном техники флуоресценции и генерации второй гармоники.
Introduction
Оптическая микроскопия стала основным методом для неразрушающего визуализации динамических процессов в живых биологических систем с внутриклеточной разрешением. Флуоресцентная микроскопия в настоящее время является наиболее популярным контраст изображения используются в живых клетках благодаря своей высокой специфичности и чувствительности 1. Большая палитра флуоресцентных зондов возникла (экзогенные красители, генетически кодируемых ими белков, полупроводниковых наночастиц). Различные образцы освещения люминесцентными на основе методики процветали (например, конфокальной или двухфотонного микроскопии) для выполнения 3D – изображений и уменьшить основной недостаток этого метода , который фотообесцвечиванию 2. Другие ограничения включают требование маркировки флуорофора, так как большинство видов молекул не свойственно флуоресцентный и, следовательно, эти флуорофоры должны быть искусственно введен в изображаемого образца. Это искусственное манипулирование может быть разрушительным, особенно для малых молекул или вызывает горшокренциальный фото-токсичность. Эти причины делают флуоресценция не микроскопии хорошо подходит для в естественных условиях наблюдений. Следовательно, применение оптических методов визуализации с высокой чувствительностью и специфических молекулярных контрастах без использования флуоресцентных молекул является весьма желательным в биомедицине.
Несколько нелинейных оптических методов визуализации без маркировки или окрашивания появились, в том числе генерации второй гармоники (ГВГ) 3,4 и генерации третьей гармоники (THG) 5. SHG микроскопии была использована для изображения структурных механизмов на супрамолекулярном уровне , такие как микротрубочки или коллагена 6. ГТГ генерируется из оптических неоднородностей , таких как интерфейс между водной средой и липидов 7. THG было также продемонстрировано на изображении миелина 8,9. Обе методики могут быть реализованы на двухфотонного флуоресцентного микроскопа и требуют только один лазерный луч. Однако они требуют интенсивности лазерного излучения высокой мощности (обычно 50мВт при 860 нм для SHG 10, 25 – 50 мВт при 1180 нм для THG 9), который является вредным в живых образцах, и не обеспечивают химическую специфичность, которая необходима для однозначного изображения конкретных биологических структур.
Химически селективного формирования изображения могут быть получены из сигналов, присущих молекулярных колебаний на основе комбинационного рассеяния. Когда луч света попадает материя, фотоны могут поглощаться и рассеиваются атомами или молекулами. Большая часть рассеянных фотонов будет иметь ту же энергию, то есть, частота, как падающих фотонов. Этот процесс называется рэлеевское рассеяние. Однако небольшое число фотонов будет рассеиваться на оптической частоте , отличной от частоты падающих фотонов, то есть с неупругого процесса рассеяния называемого комбинационного рассеяния. Разница в энергии происходит от возбуждения колебательных мод в зависимости от молекулярной структуры и окружающей среды. Поэтому СКР пров рассеяниеязей химически селективных изображений, как различные молекулы имеют определенные частоты колебаний. Тем не менее она ограничена из-за его чрезвычайно слабого сигнала. Конфокальной микроскопии комбинационного рассеяния была разработана и обеспечивает 3D – пространственное разрешение, но это требует высокой средней мощности и долгое время захвата 11. Для преодоления этих трудностей, последние достижения в области лазерной техники позволили возникновение нелинейной оптической колебательной микроскопии, в частности когерентного рассеяния антистоксова рассеяния света (КАРС) 11,12,13.
CARS представляет собой нелинейный оптический процесс третьего порядка. Три лазерные лучи, состоящие из пучка накачки на частоте © P, пучок Стокса на частоте со S и зонд пучка (чаще всего является насос) сосредоточены в образце и генерируют пучок антистоксова на частоте со As = ( 2ω P – ω S) 14. Сигнал антистоксово может быть значительно повышена, если разность частотмежду насосом и Стокса пучков настроен на комбинационном молекулярных колебаний Ом R = (ω P – ω S). Сигнал АВТОМОБИЛЕЙ основан на возможности взаимодействия нескольких фотонов. Он генерирует поэтому когерентный заказы сигнал величины сильнее, чем СКР.
АВТОМОБИЛИ микроскопии впервые была экспериментально продемонстрирована Дункана и др. 15. Zumbusch и др. Улучшилось , то технику, с помощью двух ориентированных в ближней инфракрасной области фемтосекундных лазерных лучей с объективом высокой числовой апертурой, что позволяет фазового согласования состояния автомобилей и избежать двухфотонную нерезонансную фон 16. АВТОМОБИЛИ микроскопии поэтому возникла как мощный инструмент для клеток и тканей живого изображения, путем химического обнаружения молекул , таких как липиды (через CH стретч вибрации) 17,18, воду (через ОН – стретч вибрации), белки, ДНК в живых клетках 19,20 но и дейтерированный химическое соединениеs для фармацевтических и косметических 21 приложений 22.
Основным недостатком нелинейной микроскопии происходит из-за сложности и стоимости оптических источников. Система АВТОМОБИЛИ требует двух длин волн перестраиваемых лазеров с короткими длительности импульсов и с во времени и пространстве синхронизированных импульсов. Ранние АВТОМОБИЛИ микроскопов были основаны на двух синхронизированных пикосекундном Ti: сапфирового лазеров 20. АВТОМОБИЛИ изображений была также получена из одного фемтосекундного Ti: сапфирового лазера , генерирующего источника света суперконтинуум 23. В последнее время лазерные источники, состоящие из одного фемтосекундного Ti: сапфирового лазера накачки перестраиваемого оптических параметрических генераторов (OPO) были использованы для АВТОМОБИЛЕЙ микроскопии. Эта установка позволяет внутренне синхронизирован по времени лучи с разницей частот между насосом и пучка Стокса , охватывающих весь молекулярный спектр колебаний 24. Кроме того, лазерное сканирование микроскопов основан на Turn-ключ фс лазер и ОПО, в основном используется для двухфотонная флуоресценции (ТПФ) теперь доступны для не-физиков. Потенциал таких наборов параметров может быть значительно повышена, не требуя дополнительного инвестиций за счет включения других нелинейных оптических изображений, так как каждая нелинейная (НКП) методом визуализации чувствителен к определенным структурам или молекул. Поэтому мультимодальные NLO изображений заглавной потенциал NLO микроскопии для сложных биологических образцов 25. Сочетание этих методов позволило исследование многих биологических вопросов, в частности , на липидный обмен, кожи или рак развития 26, развития скелетных мышц 27, атеросклеротических поражений 28. Кроме того, реализация лазерного сканирования луча с АВТОМОБИЛЕЙ дает возможность визуализации с высокой частотой, т.е. привлекательным инструментом для изучения динамических процессов в естественных условиях.
Целью данной работы является показать каждый шаг к реализации тон АВТОМОБИЛИ технику на стандартном многофотонная лазерного сканирующего микроскопа. Микроскопа основан на фс Ti: сапфировый лазер и ОПО (нагнетанию титан-сапфирового лазера), приводимый в действие программного обеспечения для биологов. Интеграция была выполнена путем регулировки длины одного из пути лазерного луча с целью синхронизации во времени двух пучков. Мы опишем реализацию шаг за шагом этой техники, которая требует только базовые знания в экспериментальной оптике. Мы также иллюстрируют АВТОМОБИЛИ формирования изображения, полученные на миелиновых оболочек седалищного нерва грызунов, и мы покажем это формирование изображений может выполняться одновременно с другими нелинейной оптической визуализации, такие как стандартные двухфотонному техники флуоресценции и генерации второй гармоники.
Protocol
Representative Results
Discussion
Самой сложной частью работы является временная синхронизация лазерных лучей. Это требует быстрого фотодиода в сочетании с быстрым осциллографом, но только грубое совмещение во времени, может быть выполнена в первую очередь. Затем требуется дополнительное регулирование нескольких см…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
Riferimenti
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. . Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
- Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
- Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
- Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
- Mukamel, S. . Principles of nonlinear optical spectroscopy. , (1995).
- Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
- Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
- Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -. B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
- Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
- Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106 (2011).
- Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
- Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).
- Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
- Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007 (2007).
- Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O’Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
- Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
- Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
- Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
- King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
- Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
- Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
- Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).
