Implementación de un sistema coherente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) en un Ti: Zafiro y OPO láser basado en Laser Standard Microscopio de Barrido
Summary
Coherente dispersión anti-Stokes Raman (CARS) microscopía basada en la vibración inherente de la molécula se adhiere permite imágenes de células vivas químicamente selectivo libre de etiquetas. Este trabajo presenta la aplicación de una técnica de microscopía complementaria en un microscopio de barrido láser estándar multifotónica basado en un femtosegundo Ti: zafiro láser y un láser de OPO.
Abstract
microscopios de barrido láser de femtosegundo que combinan una Ti: zafiro láser y un oscilador paramétrico óptico (OPO) para duplicar la línea de láser se han hecho disponibles para los biólogos. Estos sistemas están diseñados principalmente para múltiples canales de dos fotones microscopía de fluorescencia. Sin embargo, sin ninguna modificación, microscopía óptica no lineal complementaria tales como la generación de segundo armónico (SHG) o tercera generación armónica (THG) también se puede realizar con esta puesta a punto, permitiendo de imágenes libre de etiquetas de moléculas estructuradas o medio acuoso interfaces de lípidos. Estas técnicas son muy adecuadas para la observación in vivo, pero son limitados en la especificidad química. Químicamente imagen selectiva se puede obtener de las señales de vibración inherentes en base a la dispersión Raman. Confocal Raman microscopía proporciona una resolución espacial en 3D, pero requiere alta potencia media y de largo tiempo de adquisición. Para superar estas dificultades, los recientes avances en la tecnología láser han permitido el desarrollo de la microscopía óptica no lineal vibratorio, en particular, coherente anti-Stokes dispersión Raman (CARS). Por lo tanto, la microscopía CARS ha surgido como una poderosa herramienta para imágenes de células biológicas y en directo, por los lípidos químicamente mapeo (a través de la vibración de estiramiento CH), agua (a través de las vibraciones de estiramiento OH), proteínas o ADN. En este trabajo se describe la aplicación de la técnica de los coches en un microscopio de barrido láser estándar multifotónica OPO acoplado. Se basa en la sincronización en tiempo de las dos líneas de láser mediante el ajuste de la longitud de uno de la trayectoria del haz láser. Presentamos una implementación paso a paso de esta técnica en un sistema múltiple de fotones existentes. Una base de fondo en la óptica experimental es servicial y el sistema que se presenta no requiere costosos equipos suplementarios. También ilustramos CARS por imágenes obtenidas en las vainas de mielina del nervio ciático de roedores, y se muestra que esta imagen se puede realizar simultáneamente con otra óptica no lineal de imágenes, tal como t normawo-fotón técnica de fluorescencia y la generación de segundo armónico.
Introduction
La microscopía óptica se ha convertido en una técnica importante para la visualización no destructiva de los procesos dinámicos en los sistemas biológicos vivos con una resolución subcelular. Microscopía de fluorescencia es actualmente el contraste de imagen más popular usado en células vivas debido a su alta especificidad y sensibilidad 1. Una gran gama de sondas fluorescentes ha surgido (colorantes exógenos, las proteínas codificadas genéticamente, nanopartículas de semiconductores). Varios muestra de iluminación técnicas basadas en fluorescentes han florecido (como la microscopía confocal o de dos fotones) para realizar las imágenes en 3D y para reducir un inconveniente principal de esta técnica que se photobleaching 2. Otras limitaciones incluyen el requisito de etiquetado fluoróforo porque la mayoría de las especies moleculares no son intrínsecamente fluorescente y por lo tanto estos fluoróforos que ser introducido artificialmente en la muestra de imágenes. Esta manipulación artificial puede ser perjudicial, especialmente para las pequeñas moléculas o induzca a la ollaential fototoxicidad. Estas razones hacen que no microscopía de fluorescencia muy adecuado para las observaciones in vivo. Por lo tanto, el uso de técnicas de formación de imágenes ópticas con alta sensibilidad y contrastes moleculares específicos sin el uso de moléculas fluorescentes es muy deseable en la ciencia biomédica.
Varias técnicas de imagen óptica no lineal sin etiquetado o tinción han surgido, incluyendo la generación del segundo armónico (SHG) 3,4 y la generación de tercera armónica (THG) 5. SHG microscopía se ha utilizado para disposiciones estructurales de la imagen en el nivel supramolecular tales como microtúbulos o colágeno 6. THG se genera a partir heterogeneidades ópticas tal como la interfaz entre un medio acuoso y lípidos 7. THG También se demostró que la imagen de la mielina 8,9. Ambas técnicas se pueden implementar en un microscopio de fluorescencia de dos fotones y requieren solamente un haz de láser. Sin embargo requieren la intensidad del láser de alta potencia (típicamente 50mW a 860 nm para SHG 10, 25 – 50 mW en 1180 nm para THG 9), que es perjudicial en muestras de vida, y no proporcionan la especificidad química que se requiere para inequívocamente imagen estructuras biológicas específicas.
Químicamente imagen selectiva se puede obtener de las señales de vibración molecular inherentes en base a la dispersión Raman. Cuando un haz de luz incide en la materia, los fotones pueden ser absorbidos y dispersados por átomos o moléculas. La mayoría de los fotones dispersados tendrá la misma energía, es decir, la frecuencia, como los fotones incidentes. Este proceso se denomina dispersión de Rayleigh. Sin embargo, un pequeño número de fotones se dispersa en una frecuencia óptica diferente de la frecuencia de los fotones incidentes, es decir, con un proceso de dispersión inelástica llamada dispersión Raman. La diferencia de energía se origina a partir de la excitación de modos de vibración en función de la estructura molecular y el medio ambiente. Por lo tanto, Raman espontánea prov dispersiónidus de imagen químicamente selectivos diferentes moléculas tienen frecuencias vibratorias específicas. Sin embargo, es limitada debido a su señal extremadamente débil. Confocal Raman microscopía se ha desarrollado y proporciona una resolución espacial en 3D, pero requiere alta potencia media y la adquisición de mucho tiempo 11. Para superar estas dificultades, los recientes avances en la tecnología láser han permitido el aumento de la microscopía óptica no lineal vibratorio, en particular, dispersión coherente anti-Stokes Raman (CARS) 11,12,13.
CARS es un proceso óptico no lineal de tercer orden. Tres rayos láser, compuesto de un haz de bombeo en ω frecuencia P, un haz de Stokes a la frecuencia ω S y un haz de sonda (siendo lo más a menudo la bomba) se centran en una muestra y generan un haz de anti-Stokes a la frecuencia ω AS = ( 2ω P – ω S) 14. La señal anti-Stokes se puede mejorar de manera significativa cuando la diferencia de frecuenciaentre la bomba y el Stokes vigas está sintonizado a una R Ω vibración molecular Raman = (ω P – ω S). señal CARS se basa en la interacción múltiple de fotones. Por lo tanto, genera una señal coherentes órdenes de magnitud más fuerte que la dispersión Raman espontánea.
CARS microscopía se demostró experimentalmente por primera vez por Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Mejoró entonces la técnica, mediante el uso de dos haces de láser de femtosegundo se centraron en el infrarrojo cercano con una lente de objetivo de gran apertura numérica, que permite la condición de coincidencia de fases de coches y evitando el de dos fotones de fondo no resonante 16. Por lo tanto CARS microscopía ha surgido como una poderosa herramienta para la formación de imágenes de células y tejidos en vivo, mediante la detección de moléculas químicamente tales como lípidos (a través de la vibración de estiramiento CH) 17,18, agua (a través de las vibraciones de estiramiento OH), proteínas, ADN en células vivas 19,20 pero también deuterado compuesto químicos para la industria farmacéutica 21 y 22 aplicaciones cosméticas.
La principal limitación de la microscopía no lineal origina a partir de la complejidad y el costo de las fuentes ópticas. Un sistema CARS requiere dos láseres sintonizables de longitud de onda con duraciones de pulso corto y con trenes de impulsos sincronizados temporal y espacialmente. Los primeros microscopios CARS se basaron en dos picosegundos sincronizada Ti: zafiro láseres 20. CARS imágenes también se obtuvo a partir de una sola femtosegundo Ti: zafiro láser que genera una fuente de luz supercontinuo 23. Recientemente, fuentes de láser compuestos por un solo Ti femtosegundo: láser de zafiro de bombeo de un osciladores paramétricos ópticos sintonizables (OPO) se han utilizado para la microscopía CARS. Esta configuración permite intrínsecamente temporal sincronizada vigas con una diferencia de frecuencia entre la bomba y el haz de Stokes que cubre el espectro de vibración molecular completa 24. Además, microscopios de barrido láser basado en un volumen de negociosláser de fs clave y un OPO, que se utiliza principalmente para la fluorescencia de dos fotones (TPF) están ahora disponibles para los no-físicos. El potencial de este tipo de puestas a punto se puede mejorar en gran medida sin necesidad de inversión suplementaria por la incorporación de otras imágenes ópticas no lineales, ya que cada modalidad de imagen no lineal (NLO) es sensible a las estructuras o moléculas específicas. Por lo tanto, la imagen multimodal NLO capitaliza el potencial de la microscopía NLO para muestras biológicas complejas 25. El acoplamiento de estas técnicas ha permitido la investigación de muchos cuestiones biológicas, en particular, sobre el metabolismo de los lípidos, de la piel o cáncer de desarrollo 26, el desarrollo del músculo esquelético 27, 28 lesiones ateroscleróticas. Por otra parte, la aplicación de rayo láser de barrido con los coches da la capacidad de formación de imágenes de alta velocidad, es decir, una herramienta atractiva para estudiar los procesos dinámicos en vivo.
El objetivo de este trabajo es mostrar cada paso para poner en práctica tél CARS técnica en un microscopio de barrido láser estándar multifotónica. El microscopio se basa en un Ti FSEC: láser de zafiro y un OPO (bombeada por el Ti: Zafiro láser), operado por un software para los biólogos. La integración se llevó a cabo mediante el ajuste de la longitud de uno de la trayectoria del rayo láser con el fin de sincronizar en el tiempo los dos haces. Se describe la ejecución paso a paso de esta técnica que requiere sólo base de fondo en la óptica experimentales. También ilustramos CARS formación de imágenes obtenidas en las vainas de mielina del nervio ciático de roedores, y mostramos esta imagen se puede realizar simultáneamente con otra óptica no lineal de imágenes, tales como técnica de fluorescencia de dos fotones estándar y segundo armónico generación.
Protocol
Representative Results
Discussion
La parte más difícil del trabajo es la sincronización temporal de los rayos láser. Se requiere un fotodiodo rápido combinado con un osciloscopio rápido, pero sólo una superposición aproximada en el tiempo se puede realizar a primera. A continuación, se requiere un ajuste adicional de unos pocos centímetros. Por último, micrómetro se mueve por una etapa de traslación lineal permite realizar el ajuste fino final de la longitud de la línea de retardo con el fin de desencadenar la señal CARS. Esta señal se m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
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