に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ<em>ブルセラ</em> HeLa細胞の感染
Summary
Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.
Abstract
ブルセラ種は、それらの天然の宿主としての動物に感染する通性細胞内病原体です。ヒトへの送信は、最も一般的に感染した動物との直接接触により、または汚染された食品の摂取によって引き起こされ、重度の慢性感染症につながることができます。
ブルセラ菌は、プロと非専門的な食細胞に侵入し、小胞体（ER）由来の液胞内で複製することができます。 ER-ような区画内のブルセラ宿主細胞への侵入、リソソーム分解の回避、および複製に必要な宿主因子はほとんどわかっていません。ここでは、HeLa細胞におけるブルセラエントリおよび複製に関与する宿主因子を同定するために2つのアッセイを説明します。代替的なスクリーニング方法が適用できるがプロトコルは、RNA干渉の使用を記載しています。アッセイは、蛍光標識された細菌の検出自動使用して蛍光標識された宿主細胞に基づいています広視野顕微鏡。蛍光画像は、単一の細胞ベースの感染スコアリングを可能CellProfilerで標準化された画像解析パイプラインを用いて分析します。
エンドポイントアッセイでは、細胞内複製は感染の2日後に測定されます。これは、増殖が細菌侵入後12時間の周りに開始され、その複製ニッチへのトラフィックへの細菌を許可します。正常に細胞内ニッチを確立したブルセラ菌は、このように強く、宿主細胞内で増殖しています。細胞内細菌が大きく、個々の細胞外または細胞内の非複製の細菌数を上回るので、構成的にGFPを発現する株を使用することができます。強力なGFP信号は、感染した細胞を同定するために使用されます。
対照的に、エントリアッセイのために、細胞内および細胞外の細菌を区別することが重要です。ここでは、テトラサイクリン誘導性GFPのためのひずみエンコードが使用されます。誘導ゲンタマイシンによる細胞外細菌の同時不活性化とGFPの唯一の細胞内細菌は、GFPを発現することができることで、細胞内およびGFP信号に基づいて、細胞外細菌との区別を可能にします。細胞内増殖が開始される前に、これは、単一の細胞内細菌のロバストな検出を可能にします。
Introduction
ブルセラ種は、αプロテオバクテリアのクラスに属するグラム陰性、通性細胞内病原体です。彼らはそのような流行地域における深刻な経済的損失をもたらしウシ、ヤギ、またはヒツジなどのそれらの自然宿主における中絶や不妊の原因となります。ブルセラ症は、世界的に毎年1万人以上の新しいヒトへの感染を引き起こす最も重要な人獣共通感染症の一つです。人間への送信は、最も一般的に感染した動物との直接接触により、または低温殺菌牛乳のような汚染された食品の摂取によって引き起こされます。熱性疾患の症状は、ブルセラ症の診断に困難を引き起こす、非特異的です。未治療の場合、患者は、関節炎、心内膜炎、及び神経障害2などのより重篤な症状と慢性感染症を発症することができます。
細胞レベルではブルセラ菌は食細胞および非貪食細胞に侵入することができ、細胞内内で複製しますブルセラ含有液胞（BCV）として知られているコンパートメント。細菌の内部移行は、RAC、ロー、およびCdc42の3の直接的な活性化によって、アクチン細胞骨格の再編成が必要です。真核生物宿主細胞の内部では、BCVは、エンドサイトーシス経路に沿って入稿するとリソソームとの相互作用にもかかわらず、細菌が分解4を避けるために管理します。水疱性ATPアーゼによってBCVの酸性化は、細菌IV型分泌系（T4SS）5の発現を誘導するために必要とされます。 ブルセラ菌は 、その複製ニッチを確立するT4SSによって分泌された細菌のエフェクターは、細胞内ニッチ7の確立の欠陥にT4SS 6の削除や水疱性ATPアーゼリードの阻害するので、必須であると考えられています。細菌は彼らまで人身売買のフェーズ中に複製されません ER由来液胞コンパートメント8に達します。細胞内増殖が発生すると、BCVはCLに見出されますこのようなカルネキシンおよびグルコース-6-ホスファターゼ6のようなERマーカーと大証の関連。
ブルセラ菌は、ER-ような区画内に、細胞に入り、リソソーム分解を回避し、最終的に複製される分子メカニズムはほとんどわかっていません。感染の異なる段階に関与する宿主因子は、主にターゲットにアプローチまたはショウジョウバエ細胞9で行われる小規模な低分子干渉RNA（siRNA）は、画面によって同定されています。これらは、 ブルセラ感染の間の個々の宿主因子の寄与に光を当てるしているが、我々は、プロセス全体の包括的な理解程遠いです。
ここでは、自動化された広視野蛍光顕微鏡および自動画像解析と組み合わせて、大規模なRNA干渉（RNAi）スクリーニングを用いてヒト宿主因子の同定を可能にするプロトコルが提供されます。逆HeLa細胞のsiRNAトランスフェクションはdescribように行われますエド以前10,11のマイナーな修正を加えました。エンドポイントアッセイは、出力および隣接細胞の感染を除くブルセラ細胞内のライフサイクルの大部分を覆っています。さらに、エンドポイントアッセイで同定されたヒットを特徴付けるために、感染の初期段階に関与する因子を同定するための修正されたプロトコルが使用されます。
構成的にGFPを発現ブルセラ流産株は、細菌を二日間細胞を感染させて、エンドポイントアッセイのために使用されます。この間、細菌は細胞、ER由来の複製ニッチへのトラフィックを入力し、核周囲の空間に複製します。 GFP信号のハイレベルは、その後、確実に複製する細菌が含まれている個々の細胞を検出するために使用することができます。
ハイスループットアッセイにおけるブルセラエントリを研究するために、細胞内および細胞外の細菌を区別できることが重要です。この方法は、ここに提示circumv細胞内および細胞外の細菌のエント差動抗体染色。これは、DsRedのの構成的発現と組み合わせたテトラサイクリン誘導性GFPを発現ブルセラ株に基づいています。構成のDsRedマーカーの存在は、試料中に存在するすべての細菌の同定を可能にします。 GFP発現は、ゲンタマイシン（GM）によって細胞外の細菌の不活性化と同時に非毒性テトラサイクリンアナログアンヒドロテトラサイクリン（ATC）の添加によって誘導されます。細胞不透過性抗生物質Gmは細胞外細菌を死滅させる一方で、ATCは、宿主細胞に入り、細胞内細菌に選択的にGFPの発現を誘導することができます。このデュアルレポーターは、広視野顕微鏡を用いて細胞外細菌（のみのDsRed信号）からの単一細胞内細菌（GFPとDsRedの信号）の堅牢な分離を可能にします。細胞内ブルセラによって検出可能なGFP発現を達成するために、我々は、ATCによる誘導の4時間はRELIになることを見出しましたできる信号。選択的細胞内細菌でGFPを発現するための同様の誘導方式は、細胞内の赤痢菌 12を研究するために以前に使用されてきました。
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacterial pathogens have evolved numerous strategies to manipulate eukaryotic host cells to their benefit. Pathogens causing acute infections often show rapid proliferation which is accompanied by significant alarming of the immune system and loss of viability of infected cells. In contrast, Brucella and other pathogens that cause chronic infections manage to establish long-lasting interactions within host cells. Therefore, bacteria need to fine tune host cell functions to their benefit without disrupting cellul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants 51RT 0_126008 and 51RTP0_151029 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX and TargetInfectX, respectively, in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology. We acknowledge grant 310030B_149886 from the Swiss National Science Foundation (SNSF). Work of S.H.L and A.C. was supported by the International PhD Program “Fellowships for Excellence” of the Biozentrum. Simone Muntwiler is acknowledged for technical assistance. We would like to thank Dirk Bumann for providing pNF106 and Jean Celli for pJC43 and pJC44.
Materials
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used. |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 ug/ml solution in 100% ethanol is kept at -20°C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20°C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTTTTGAATTCTGGCAATTCCGACGTCTAAGAAACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTTTTGTCGACTTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10x objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20mm, DIC Prism: 10x, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1392 x 1040 imaging pixels, 6.45 x 6.45-µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25×36 |
Riferimenti
- Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
- Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
- Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
- Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
- Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
- Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
- Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
- Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
- Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
- Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
- Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
- Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
- von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
