Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l'hôte impliqués dans<em> Brucella</em> L'infection des cellules HeLa
Summary
Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.
Abstract
Espèces de Brucella sont des agents pathogènes intracellulaires facultatifs qui infectent les animaux comme leurs hôtes naturels. La transmission aux humains est le plus souvent causée par un contact direct avec des animaux infectés ou par ingestion d'aliments contaminés et peut conduire à des infections chroniques graves.
Brucella peut envahir les cellules phagocytaires professionnels et non-professionnels et réplique au sein du réticulum endoplasmique (RE) de vacuoles -derived. Les facteurs de l' hôte requis pour l' entrée Brucella dans des cellules hôtes, éviter la dégradation lysosomale, et la réplication dans le compartiment ER-like demeurent largement inconnus. Nous décrivons ici deux essais pour identifier les facteurs de l' hôte impliqués dans Brucella l' entrée et la réplication dans les cellules HeLa. Les protocoles décrivent l'utilisation de l'interférence ARN, alors que les méthodes de criblage alternatives pourraient être appliquées. Les essais sont basés sur la détection de bactéries marquées par fluorescence dans les cellules hôtes marquées par fluorescence en utilisant automatiséla microscopie à champ large. Les images fluorescentes sont analysées à l'aide d'un pipeline d'analyse d'image normalisée dans CellProfiler qui permet l'infection par simple pointage à base de cellules.
Dans l'essai de point final, la réplication intracellulaire est mesurée deux jours après l'infection. Cela permet aux bactéries de trafic vers leur niche réplicative où la prolifération est lancé autour de 12 heures après l' entrée bactérienne. Brucella qui ont établi avec succès une niche intracellulaire aura ainsi fortement proliféré à l' intérieur des cellules hôtes. Comme les bactéries intracellulaires grandement plus nombreux que les bactéries non réplicatifs extracellulaires ou intracellulaires individuels, une souche exprimant constitutivement GFP peut être utilisé. Le signal de la GFP solide est ensuite utilisé pour identifier les cellules infectées.
En revanche, pour le dosage d'entrée, il est essentiel de faire la distinction entre les bactéries intracellulaires et extracellulaires. Ici, un codage de déformation pour une GFP inductible par la tétracycline est utilisée. Inductionde la GFP avec l'inactivation simultanée des bactéries extracellulaires par la gentamicine permet la différenciation entre intracellulaire et extracellulaire des bactéries en fonction du signal de la GFP, seules les bactéries intracellulaires étant capable d'exprimer la GFP. Ceci permet la détection des bactéries intracellulaires robuste unique avant la prolifération intracellulaire est initiée.
Introduction
Espèces de Brucella sont, les agents pathogènes intracellulaires facultatifs Gram négatif appartenant à la classe des α-protéobactéries. Ils provoquent des avortements et l'infertilité chez leurs hôtes naturels tels que les bovins, les chèvres, les moutons ou entraînant des pertes économiques sévères dans les zones endémiques. La brucellose est l' une des maladies zoonotiques les plus importants dans le monde entier causant plus d' un demi – million de nouvelles infections humaines par an 1. La transmission à l'homme est le plus souvent causée par un contact direct avec des animaux infectés ou par ingestion d'aliments contaminés tels que le lait non pasteurisé. Les symptômes de la maladie fébrile sont non spécifiques, ce qui provoque des difficultés pour le diagnostic de la brucellose. Si non traitée, les patients peuvent développer une infection chronique avec des symptômes plus graves tels que l' arthrite, l' endocardite et la neuropathie 2.
Au niveau cellulaire Brucella est capable d'envahir les cellules phagocytaires et non phagocytaires et reproduit dans un intracellulairecompartiment connu sous le nom de la vacuole Brucella (BCV). Internalisation des bactéries nécessite des réarrangements du cytosquelette d'actine par Rac, Rho, et l' activation directe de Cdc42 3. A l' intérieur de la cellule hôte eucaryote, la BCV trafique le long de la voie endocytique et en dépit de l'interaction avec les lysosomes, les bactéries parviennent à éviter une dégradation 4. L' acidification de la BCV par le vésiculaire ATPase est nécessaire pour induire l'expression du système IV de sécrétion de type bactérien (T4SS) 5. On croit que les effecteurs bactériennes sécrétées par le T4SS sont essentiels pour Brucella pour établir son créneau réplicative, depuis la suppression de la T4SS 6 ou l' inhibition de l'ATPase plomb vésiculaire à des défauts dans la mise en place de la niche intracellulaire 7. Les bactéries ne se répliquent pas pendant la phase de la traite jusqu'à ce qu'ils parvenir à un compartiment vacuolaire ER dérivé 8. Une fois la prolifération intracellulaire se produit, la BCV se trouve dans classociation OSE avec des marqueurs tels que l' ER calnexine et le glucose-6-phosphatase 6.
Les mécanismes moléculaires par lesquels Brucella pénètre dans les cellules, évite la dégradation lysosomale, et enfin se réplique dans un compartiment ER-like demeurent largement inconnus. Les facteurs de l' hôte impliqués dans différentes étapes de l' infection ont principalement été identifiés par des approches ciblées ou un écran à petite échelle petits ARN interférents (siRNA) effectuée dans les cellules de drosophile 9. Ceux – ci ont mis en lumière la contribution des facteurs d'accueil individuels au cours de l' infection à Brucella , mais nous sommes encore loin d'une compréhension globale de l'ensemble du processus.
Ici, les protocoles qui permettent l'identification des facteurs de l'hôte humain en utilisant à grande échelle l'interférence ARN (ARNi) criblage en combinaison avec automatisée de microscopie par fluorescence à champ large et analyse d'image automatisée sont présentés. La transfection inverse de siRNA de cellules HeLa On procède comme described tôt 10,11 avec des modifications mineures. Le dosage de point final couvre une grande partie du cycle de vie intracellulaire Brucella , sauf la sortie et l'infection des cellules voisines. Pour caractériser davantage les résultats identifiés dans l'essai de point final, un protocole modifié pour identifier les facteurs qui interviennent dans les étapes précoces de l'infection est utilisée.
Une souche de Brucella abortus qui exprime constitutivement la GFP est utilisée pour l'essai de point d' extrémité , où les bactéries sont autorisés à infecter les cellules pendant deux jours. Pendant ce temps, les bactéries pénètrent dans les cellules, le trafic à la niche réplicative dérivés d'ER, et de reproduire dans l'espace péri-nucléaire. Les niveaux élevés de signal GFP peuvent ensuite être utilisés pour détecter de manière fiable les cellules individuelles contiennent des bactéries qui se répliquant.
Pour étudier l' entrée Brucella dans un dosage à haut débit, il est important de pouvoir distinguer entre les bactéries intracellulaires et extracellulaires. La méthode présentée ici circumvents anticorps différentiel coloration des bactéries intracellulaires et extracellulaires. Il est basé sur une souche de Brucella exprimant une GFP inductible par la tetracycline en combinaison avec l' expression constitutive de la DsRed. La présence d'un marqueur DsRed constitutif permet l'identification de toutes les bactéries présentes dans l'échantillon. expression de la GFP est induite par l'addition de tetracycline anhydrotétracycline analogue non toxique (ATC) en même temps que l'inactivation des bactéries extracellulaires par la gentamicine (Gm). Bien que la cellule imperméable aux antibiotiques Gm tue les bactéries extracellulaires, Atc peut entrer dans la cellule hôte et induire l'expression de la GFP sélectivement dans des bactéries intracellulaires. Cette double rapporteur permet la séparation solide des bactéries intracellulaires simples (GFP et DsRed signaux) provenant de bactéries extracellulaires (uniquement de signaux DsRed) en utilisant la microscopie à champ large. Afin d'atteindre l' expression de GFP détectable par intracellulaire Brucella nous avons constaté que 4 heures d'induction par l' ATC se traduit par un relisignal de mesure. Induction des systèmes similaires pour exprimer sélectivement GFP dans des bactéries intracellulaires a été utilisé auparavant pour étudier Shigella intracellulaire 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacterial pathogens have evolved numerous strategies to manipulate eukaryotic host cells to their benefit. Pathogens causing acute infections often show rapid proliferation which is accompanied by significant alarming of the immune system and loss of viability of infected cells. In contrast, Brucella and other pathogens that cause chronic infections manage to establish long-lasting interactions within host cells. Therefore, bacteria need to fine tune host cell functions to their benefit without disrupting cellul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants 51RT 0_126008 and 51RTP0_151029 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX and TargetInfectX, respectively, in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology. We acknowledge grant 310030B_149886 from the Swiss National Science Foundation (SNSF). Work of S.H.L and A.C. was supported by the International PhD Program “Fellowships for Excellence” of the Biozentrum. Simone Muntwiler is acknowledged for technical assistance. We would like to thank Dirk Bumann for providing pNF106 and Jean Celli for pJC43 and pJC44.
Materials
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used. |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 ug/ml solution in 100% ethanol is kept at -20°C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20°C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTTTTGAATTCTGGCAATTCCGACGTCTAAGAAACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTTTTGTCGACTTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10x objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20mm, DIC Prism: 10x, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1392 x 1040 imaging pixels, 6.45 x 6.45-µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25×36 |
Riferimenti
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