होस्ट में शामिल कारक के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए माइक्रोस्कोपी आधारित assays<em> ब्रूसिला</em> हेला कोशिकाओं के संक्रमण
Summary
Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.
Abstract
ब्रूसिला प्रजातियों ऐच्छिक intracellular रोगज़नक़ों कि उनके प्राकृतिक मेजबान के रूप में जानवरों को संक्रमित कर रहे हैं। मनुष्य के लिए ट्रांसमिशन सबसे अधिक संक्रमित जानवरों के साथ सीधे संपर्क से या दूषित भोजन की घूस के कारण होता है और गंभीर क्रोनिक संक्रमण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
ब्रूसिला पेशेवर और गैर-पेशेवर phagocytic कोशिकाओं पर आक्रमण और जालिका (ईआर) व्युत्पन्न रिक्तिकाएं भीतर प्रतिकृति कर सकते हैं। मेजबान ईआर-तरह के डिब्बे में मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश ब्रूसिला, लाइसोसोमल गिरावट के परिहार, और नकल के लिए आवश्यक कारकों को काफी हद तक अनजान रहते हैं। यहाँ हम ब्रूसिला प्रवेश और हेला कोशिकाओं में प्रतिकृति में शामिल मेजबान कारकों की पहचान करने के लिए दो assays का वर्णन है। प्रोटोकॉल, शाही सेना के हस्तक्षेप के उपयोग का वर्णन करते हुए वैकल्पिक स्क्रीनिंग तरीकों से लागू किया जा सकता है। assays fluorescently लेबल बैक्टीरिया का पता लगाने में fluorescently लेबल मेजबान स्वचालित का उपयोग कोशिकाओं के आधार पर कर रहे हैंव्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी। फ्लोरोसेंट छवियों CellProfiler में एक मानकीकृत छवि विश्लेषण पाइपलाइन जो एकल कोशिका आधारित संक्रमण स्कोरिंग की अनुमति देता का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं।
समापन बिंदु परख में, intracellular प्रतिकृति दो दिनों के संक्रमण के बाद मापा जाता है। यह उनकी replicative आला जहां प्रसार जीवाणु प्रवेश। ब्रूसिला जो सफलतापूर्वक एक intracellular आला की स्थापना की है, इस प्रकार दृढ़ता से मेजबान कोशिकाओं के अंदर proliferated है जाएगा के बाद 12 घंटा के आसपास शुरू की है करने के लिए यातायात के लिए बैक्टीरिया की अनुमति देता है। चूंकि intracellular बैक्टीरिया बहुत व्यक्ति बाह्य या intracellular गैर replicative बैक्टीरिया की संख्या से बढ़ना होगा, एक तनाव अनिवार्यता से व्यक्त GFP इस्तेमाल किया जा सकता है। मजबूत GFP संकेत तो संक्रमित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
इसके विपरीत, प्रवेश परख के लिए यह intracellular और बाह्य बैक्टीरिया के बीच अंतर करने के लिए आवश्यक है। इधर, एक टेट्रासाइक्लिन inducible GFP के लिए एक तनाव एन्कोडिंग प्रयोग किया जाता है। अधिष्ठापनजेंटामाइसिन द्वारा बाह्य बैक्टीरिया के एक साथ निष्क्रियता के साथ GFP के intracellular और बाह्य बैक्टीरिया GFP संकेत के आधार पर भेदभाव के बीच में सक्षम बनाता है, केवल intracellular बैक्टीरिया GFP व्यक्त करने के लिए सक्षम होने के साथ। यह एकल intracellular बैक्टीरिया का पता लगाने से पहले मजबूत intracellular प्रसार शुरू की है की अनुमति देता है।
Introduction
ब्रूसिला प्रजातियों ग्राम नकारात्मक, ऐच्छिक intracellular α-Proteobacteria के वर्ग से संबंधित रोगजनक हैं। वे इस तरह के मवेशी, बकरी, भेड़ या स्थानिक क्षेत्रों में गंभीर आर्थिक नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप के रूप में गर्भपात और उनके प्राकृतिक मेजबान टीम में बांझपन का कारण है। ब्रूसिलोसिस सबसे महत्वपूर्ण जूनोटिक रोगों दुनिया भर में आधे से एक लाख नए मानव में संक्रमण प्रतिवर्ष 1 से अधिक के कारण से एक है। मानव के लिए ट्रांसमिशन सबसे अधिक ऐसे क्रीम दूध के रूप में संक्रमित जानवरों के साथ सीधे संपर्क से या दूषित भोजन की घूस के कारण होता है। ज्वर की बीमारी के लक्षण unspecific कर रहे हैं, जो ब्रूसीलोसिस का निदान करने में कठिनाइयों का कारण बनता है। अगर इलाज, रोगियों गठिया, अन्तर्हृद्शोथ, और न्यूरोपैथी 2 के रूप में और अधिक गंभीर लक्षणों के साथ एक पुराने संक्रमण विकसित कर सकते हैं।
सेलुलर स्तर पर ब्रूसिला phagocytic और गैर-phagocytic कोशिकाओं पर आक्रमण करने में सक्षम है और एक intracellular भीतर प्रतिकृतिब्रूसिला युक्त रिक्तिका (BCV) के रूप में जाना जाता डिब्बे। बैक्टीरिया के internalization आरएसी, रो, और Cdc42 3 के प्रत्यक्ष सक्रियण द्वारा actin cytoskeleton rearrangements की आवश्यकता है। यूकेरियोटिक मेजबान कोशिका के अंदर, BCV endocytic मार्ग के साथ traffics और लाइसोसोम के साथ बातचीत के बावजूद, बैक्टीरिया गिरावट 4 से बचने के लिए लेते हैं। Vesicular ATPase द्वारा BCV के अम्लीकरण बैक्टीरियल प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली (T4SS) 5 की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने की आवश्यकता है। यह माना जाता है कि बैक्टीरियल T4SS द्वारा स्रावित प्रभावोत्पादक आवश्यक ब्रूसिला अपनी replicative आला स्थापित करने के लिए कर रहे हैं, T4SS 6 का विलोपन या vesicular ATPase नेतृत्व के निषेध intracellular आला 7 की स्थापना में दोष के बाद से। जीवाणु तक वे तस्करी के चरण के दौरान नहीं दोहराने एक ईआर व्युत्पन्न vacuolar डिब्बे 8 तक पहुँचने। एक बार जब intracellular प्रसार होता है, BCV सीएल में पाया जाता हैऐसे calnexin और ग्लूकोज-6-फॉस्फेट के रूप में 6 ईआर मार्कर के साथ OSE एसोसिएशन।
आणविक तंत्र है जिसके द्वारा ब्रूसिला में प्रवेश करती है कोशिकाओं, लाइसोसोमल गिरावट से बचा जाता है, और अंत में replicates एक ईआर-तरह के डिब्बे में काफी हद तक अनजान रहते हैं। संक्रमण के विभिन्न चरणों को होस्ट में शामिल कारक मुख्य रूप से लक्षित दृष्टिकोण या एक छोटे पैमाने पर छोटे दखल शाही सेना (siRNA) ड्रोसोफिला कोशिकाओं 9 में प्रदर्शन स्क्रीन के द्वारा पहचान की गई है। ये ब्रूसिला संक्रमण के दौरान अलग-अलग मेजबान कारकों के योगदान पर प्रकाश डाला है, लेकिन हम अभी भी पूरी प्रक्रिया के लिए एक व्यापक समझ से दूर हैं।
इधर, प्रोटोकॉल है कि बड़े पैमाने पर शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) स्वचालित व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और स्वचालित छवि विश्लेषण के साथ संयोजन में स्क्रीनिंग का उपयोग मानव मेजबान कारकों की पहचान की अनुमति प्रस्तुत कर रहे हैं। हेला कोशिकाओं की रिवर्स siRNA अभिकर्मक describ के रूप में किया जाता हैएड पहले 10,11 मामूली संशोधनों के साथ। समापन बिंदु परख निकास और पड़ोसी कोशिकाओं के संक्रमण को छोड़कर ब्रूसिला intracellular जीवन चक्र का एक बड़ा हिस्सा शामिल किया गया है। आगे हिट समापन बिंदु परख में पहचान की विशेषताएँ करने के लिए, संक्रमण के शुरुआती चरणों में शामिल कारकों की पहचान के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रयोग किया जाता है।
एक ब्रूसिला abortus तनाव है कि अनिवार्यता से GFP व्यक्त समापन बिंदु परख जहां बैक्टीरिया दो दिनों के लिए कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए अनुमति दी जाती है के लिए प्रयोग किया जाता है। इस समय के दौरान, बैक्टीरिया ईआर व्युत्पन्न replicative आला करने के लिए कोशिकाओं, यातायात दर्ज करें, और पेरी परमाणु अंतरिक्ष में पेश करता है। GFP संकेत के उच्च स्तर पर तो मज़बूती से व्यक्ति की कोशिकाओं पर जो नकल बैक्टीरिया होते हैं पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
एक उच्च throughput परख में ब्रूसिला प्रविष्टि का अध्ययन करने के लिए, यह intracellular और बाह्य बैक्टीरिया के बीच भेद करने में सक्षम होना करने के लिए महत्वपूर्ण है। विधि यहाँ प्रस्तुत circumvintracellular और बाह्य बैक्टीरिया के दस्तावेजों अंतर एंटीबॉडी धुंधला। यह एक ब्रूसिला तनाव dsRed के विधान अभिव्यक्ति के साथ संयोजन में एक टेट्रासाइक्लिन inducible व्यक्त GFP पर आधारित है। एक विधान dsRed मार्कर की उपस्थिति सभी बैक्टीरिया है कि नमूने में मौजूद हैं की पहचान के लिए अनुमति देता है। GFP अभिव्यक्ति जेंटामाइसिन द्वारा गैर विषैले टेट्रासाइक्लिन अनुरूप anhydrotetracycline (एटीसी) एक साथ बाह्य बैक्टीरिया की निष्क्रियता के साथ के अलावा (जीएम) से प्रेरित है। जबकि सेल अभेद्य एंटीबायोटिक ग्राम कोशिकी जीवाणुओं को मारता है, एटीसी मेजबान कोशिका में प्रवेश और intracellular बैक्टीरिया में चुनिंदा GFP अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित कर सकते हैं। इस दोहरी संवाददाता कोशिकी बैक्टीरिया (केवल DsRed संकेत) से एकल intracellular बैक्टीरिया (GFP और dsRed संकेत) के मजबूत जुदाई व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग की अनुमति देता है। आदेश intracellular ब्रूसिला द्वारा detectable GFP अभिव्यक्ति तक पहुंचने के लिए हमने पाया है कि एटीसी से प्रेरण के 4 घंटा एक धर्म में यह परिणामसक्षम संकेत। इसी प्रेरण योजनाओं चुनिंदा intracellular बैक्टीरिया में GFP व्यक्त करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है intracellular शिगेला 12 अध्ययन करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacterial pathogens have evolved numerous strategies to manipulate eukaryotic host cells to their benefit. Pathogens causing acute infections often show rapid proliferation which is accompanied by significant alarming of the immune system and loss of viability of infected cells. In contrast, Brucella and other pathogens that cause chronic infections manage to establish long-lasting interactions within host cells. Therefore, bacteria need to fine tune host cell functions to their benefit without disrupting cellul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants 51RT 0_126008 and 51RTP0_151029 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX and TargetInfectX, respectively, in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology. We acknowledge grant 310030B_149886 from the Swiss National Science Foundation (SNSF). Work of S.H.L and A.C. was supported by the International PhD Program “Fellowships for Excellence” of the Biozentrum. Simone Muntwiler is acknowledged for technical assistance. We would like to thank Dirk Bumann for providing pNF106 and Jean Celli for pJC43 and pJC44.
Materials
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used. |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 ug/ml solution in 100% ethanol is kept at -20°C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20°C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTTTTGAATTCTGGCAATTCCGACGTCTAAGAAACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTTTTGTCGACTTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10x objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20mm, DIC Prism: 10x, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1392 x 1040 imaging pixels, 6.45 x 6.45-µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25×36 |
Riferimenti
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