Микроскопия основе Анализы для высокопроизводительного скрининга на хост факторов, участвующих в<em> Brucella</em> Инфицирование клеток HeLa
Summary
Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.
Abstract
Бруцелл являются факультативными внутриклеточными патогенами , которые инфицируют животных в их естественных хозяев. Передача инфекции человеку чаще всего вызывается при непосредственном контакте с инфицированными животными или при употреблении зараженной пищи и может привести к серьезным хроническим инфекциям.
Brucella могут вторгнуться профессиональные и непрофессиональные клетки фагоцитоза и размножается в пределах эндоплазматической сети (ER) -derived вакуолей. Факторы , принимающие необходимые для ввода Brucella в клетки – хозяева, предотвращение деградации лизосомной и репликации в ER-подобные отделения остаются неизвестными. Здесь мы опишем два анализов для выявления факторов хозяина , участвующих в записи Brucella и репликации в клетках HeLa. Протоколы описывают использование РНК-интерференции, в то время как альтернативные методы скрининга могут быть применены. Анализы основаны на обнаружении флуоресцентно меченных бактерий в флуоресцентно меченных клетках-хозяевах с использованием автоматизированныхширокого поля микроскопии. Флуоресцентные изображения анализируются с использованием стандартизированного трубопровода для анализа изображений в CellProfiler, который позволяет одноклеточной на основе инфекции скоринг.
В анализе конечных точек, внутриклеточный репликации измеряется через два дня после инфицирования. Это позволяет бактериям трафика на их репликативной нишу , где распространение инициируется около 12 часов после того, как бактериальная запись. Бруцелл , которые успешно создали внутриклеточный нишу, таким образом , сильно пролиферируют внутри клеток – хозяев. Так как внутриклеточных бактерий значительно превышает количество индивидуальных внеклеточные или внутриклеточные нерепликативная бактерии, штамм конститутивно экспрессирующих GFP может быть использован. Сильный сигнал GFP, затем используется для идентификации зараженных клеток.
В отличие от этого, для анализа начального необходимо проводить различие между внутриклеточным и внеклеточным бактерий. Здесь используется кодирующий штамм для тетрациклина индуцируемого GFP. индукционныйиз GFP с одновременной инактивацией внеклеточных бактерий гентамицин позволяет дифференцировать внутриклеточным и внеклеточным бактерий на основе сигнала GFP, с только внутриклеточных бактерий в состоянии выразить GFP. Это позволяет надежное детектирование единичных внутриклеточных бактерий, прежде чем внутриклеточный пролиферации инициируется.
Introduction
Бруцелл являются грамотрицательные, факультативные внутриклеточные возбудители , принадлежащие к классу альфа-протеобактерий. Они вызывают выкидыши и бесплодие в их естественных хозяев, таких как крупный рогатый скот, коз, овец или приводит к серьезным экономическим потерям в эндемичных районах. Бруцеллез является одним из самых важных зоонозных заболеваний во всем мире , вызывая более полумиллиона новых человеческих инфекций ежегодно 1. Передача к человеку чаще всего вызывается при непосредственном контакте с инфицированными животными или при употреблении зараженной пищи, такие как непастеризованного молока. Симптомы лихорадочного заболевания неспецифичны, что вызывает трудности в диагностике бруцеллеза. При отсутствии лечения у пациентов может развиться хроническая инфекция с более тяжелыми симптомами , такими как артрит, эндокардит и невропатии 2.
На клеточном уровне бруцелл способен к вторжению фагоцитоза и не фагоцитарной клетки и реплицируется в внутриклеточнымкупе известна как Brucella катио- вакуоли (BCV). Интернализации бактерий требует цитоскелета перестроек с помощью Rac, Rho и прямой активации Cdc42 3. Внутри эукариотической клетки – хозяина, то BCV трафиков вдоль эндоцитотического пути и , несмотря на взаимодействие с лизосом, бактерии удается избежать деградации 4. Подкисление BCV по везикулярного АТФазы требуется , чтобы индуцировать экспрессию системы секреции IV типа (бактериальный T4SS) 5. Считается , что бактериальные эффекторы , секретируемые T4SS имеют важное значение для бруцелл , чтобы установить свою нишу репликативной, так как делеции T4SS 6 или ингибирования везикулярного АТФазы приводят к дефектам в создании внутриклеточного ниши 7. Бактерии не размножаются во время фазы торговли, пока они достичь ЭР-производных вакуолярной отсек 8. После того, как происходит внутриклеточное пролиферации, то BCV находится в слОСЭ ассоциации с маркерами ER , таких как калнексину и глюкозо-6-фосфатазы 6.
Молекулярные механизмы , с помощью которых Brucella проникает в клетку, позволяет избежать деградации лизосомами, и , наконец , размножается в ER-подобные отделения остаются неизвестными. Факторы хозяина , участвующие в различных стадиях инфекции главным образом были определены целевые подходы или малых интерферирующих РНК экрана малого масштаба (миРНК) в исполнении Drosophila клеток 9. Они проливают свет на вклад отдельных факторов хозяина во время Brucella инфекции , но мы все еще далеки от полного понимания всего процесса.
Здесь, протоколы, позволяющие идентифицировать факторов хозяина человека с использованием крупномасштабной РНК-интерференция (RNAi) скрининг в сочетании с автоматизированной широким полем флуоресцентной микроскопии и анализа изображения в автоматическом режиме представлены. Обратный миРНК трансфекции клеток HeLa проводили как describред ранее 10,11 с незначительными изменениями. Анализ конечных точек покрывает большую часть внутриклеточного жизненного цикла Brucella , за исключением выхода и инфекции соседних клеток. Для дополнительной характеристики хитов, выявленные при анализе конечных точек, модифицированный протокол с целью выявления факторов, участвующих в ранних стадиях инфекции используется.
Выкидыш штамм бруцелл , который конститутивно экспрессирует GFP используется для анализа конечных точек , где бактерии пoлучают инфицировать клетки в течение двух дней. За это время, бактерии проникают в клетки, трафик в ЭР-производных репликативной нишу, и реплицировать в пери-ядерном пространстве. Высокие уровни сигнала GFP может быть использован, чтобы надежно обнаружить отдельные клетки, которые содержат реплицирующиеся бактерии.
Для включения в исследование бруцелл в тесте с высокой пропускной способностью , важно , чтобы иметь возможность различать внутриклеточной и внеклеточной бактерий. Изложенный здесь метод circumvЭНЦ дифференциальное окрашивание антитела внутриклеточной и внеклеточной бактерий. Он основан на штамма Brucella , выражающей Тетрациклин-индуцируемых GFP в сочетании с конститутивной экспрессии DsRed. Присутствие конститутивным DsRed маркера позволяет идентифицировать все бактерии, которые присутствуют в образце. выражение GFP индуцируется добавлением нетоксичного тетрациклина аналогового anhydrotetracycline (АТЦ) одновременно с инактивацией внеклеточных бактерий гентамицина (Gm). В то время как клетка-непроницаемой антибиотик Gm убивает внеклеточные бактерии, АТГ могут проникать в клетку-хозяина и индуцирует экспрессию GFP избирательно в внутриклеточных бактерий. Этот двойной репортер позволяет надежное разделение отдельных внутриклеточных бактерий (GFP и DsRed сигналов) от внеклеточных бактерий (только DsRed сигналов) с использованием широкого поля микроскопии. Для того , чтобы достичь обнаруживаемого экспрессии GFP с помощью внутриклеточной Brucella мы обнаружили , что 4 ч индукции AtC приводит к RELIсостоянии сигнала. Подобные схемы индукции выборочно выражающие GFP в внутриклеточных бактерий был использован ранее для изучения внутриклеточных Shigella 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacterial pathogens have evolved numerous strategies to manipulate eukaryotic host cells to their benefit. Pathogens causing acute infections often show rapid proliferation which is accompanied by significant alarming of the immune system and loss of viability of infected cells. In contrast, Brucella and other pathogens that cause chronic infections manage to establish long-lasting interactions within host cells. Therefore, bacteria need to fine tune host cell functions to their benefit without disrupting cellul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants 51RT 0_126008 and 51RTP0_151029 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX and TargetInfectX, respectively, in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology. We acknowledge grant 310030B_149886 from the Swiss National Science Foundation (SNSF). Work of S.H.L and A.C. was supported by the International PhD Program “Fellowships for Excellence” of the Biozentrum. Simone Muntwiler is acknowledged for technical assistance. We would like to thank Dirk Bumann for providing pNF106 and Jean Celli for pJC43 and pJC44.
Materials
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used. |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 ug/ml solution in 100% ethanol is kept at -20°C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20°C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTTTTGAATTCTGGCAATTCCGACGTCTAAGAAACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTTTTGTCGACTTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10x objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20mm, DIC Prism: 10x, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1392 x 1040 imaging pixels, 6.45 x 6.45-µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25×36 |
Riferimenti
- Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
- Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
- Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
- Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
- Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
- Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
- Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
- Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
- Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
- Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
- Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
- Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
- von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
