Mikroskopie-basierte Assays für die Hochdurchsatz-Screening von Host beteiligten Faktoren in<em> Brucella</em> Die Infektion von HeLa-Zellen
Summary
Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.
Abstract
Brucella – Arten sind fakultativ intrazelluläre Erreger, die Tiere als ihre natürlichen Wirte infizieren. Übertragung auf den Menschen wird am häufigsten durch direkten Kontakt mit infizierten Tieren verursacht oder durch die Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln und kann zu schweren chronischen Infektionen führen.
Brucella können professionelle und nicht-professionelle Phagozyten eindringen und repliziert innerhalb endoplasmatischen Retikulum (ER) abgeleitetes Vakuolen. Die Wirtsfaktoren für Brucella Eintritt in Wirtszellen, die Vermeidung von lysosomalen Abbau erforderlich ist , und die Replikation in der ER-ähnlichen Fach bleiben weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir zwei Assays Wirtsfaktoren beteiligt in Brucella Eintrag und Replikation in HeLa – Zellen zu identifizieren. Die Protokolle beschreiben die Verwendung von RNA-Interferenz, während alternative Screening-Verfahren angewendet werden könnten. Die Assays basieren auf der Detektion von fluoreszenzmarkierten Bakterien in fluoreszenzmarkierte Wirtszellen unter Verwendung automatisierterWeitfeldmikroskopie. Die Fluoreszenzbilder werden analysiert, um eine standardisierte Bildanalyse-Pipeline in CellProfiler verwendet, die einzelnen zellbasierten Infektion Scoring ermöglicht.
Im Endpunkt-Assay wird die intrazelluläre Replikation zwei Tage nach der Infektion gemessen. Auf diese Weise können Bakterien Besucher auf ihre replikativen Nische , wo die Proliferation um 12 Stunden nach der bakteriellen Eintritt initiiert wird. Brucella , die erfolgreich eine intrazelluläre Nische etabliert haben so stark innerhalb von Wirtszellen vermehrt haben wird. Da intrazelluläre Bakterien stark einzelne extrazelluläre oder intrazelluläre nicht-replikativen Bakterien überwiegen werden, die konstitutiv ein Stamm GFP exprimieren, können verwendet werden. Das starke GFP-Signal wird dann verwendet, infizierte Zellen zu identifizieren.
Im Gegensatz dazu ist für den Eintrag Test ist es wichtig, zwischen intra- und extrazellulären Bakterien zu unterscheiden. Hier wird ein Stamm, kodierend für ein Tetracyclin-induzierbarer GFP verwendet. Induktionvon Gentamicin von GFP bei gleichzeitiger Inaktivierung von extrazellulären Bakterien ermöglicht die Unterscheidung zwischen intra- und extrazellulären auf dem GFP-Signal basierend Bakterien, mit nur intrazelluläre Bakterien in der Lage zu sein GFP zu exprimieren. Dies ermöglicht die robuste Detektion einzelner intrazellulären Bakterien, bevor die intrazelluläre Vermehrung initiiert wird.
Introduction
Brucella Spezies gram-negative, fakultativ intrazelluläre Pathogene zur Klasse der α-Proteo gehören. Sie verursachen Abtreibungen und Unfruchtbarkeit in ihren natürlichen Wirten wie Rinder, Ziegen oder Schafe was zu schweren wirtschaftlichen Verlusten in Endemiegebieten. Brucellose ist eine der wichtigsten Zoonosen weltweit verursacht mehr als eine halbe Million neue Infektionen beim Menschen jährlich 1. Die Übertragung auf menschliche wird am häufigsten durch direkten Kontakt mit infizierten Tieren verursacht oder durch die Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln wie nicht pasteurisierte Milch. Symptome der fieberhafte Erkrankung sind unspezifisch, was Schwierigkeiten bei der Diagnose von Brucellose verursacht. Wenn unbehandelt, können Patienten eine chronische Infektion mit schwereren Symptomen entwickeln , wie Arthritis, Endocarditis und Neuropathie 2.
Auf zellulärer Ebene ist Brucella können phagozytische und nicht-Phagozyten und repliziert innerhalb eines intrazellulären einzufallenFach wie die Vakuole -haltigen Brucella bekannt (BCV). Internalisierung von Bakterien erfordert von Rac, Rho Aktinzytoskelett Umlagerungen und direkte Aktivierung von Cdc42 3. Innerhalb der eukaryotischen Wirtszelle, verkehre die BCV entlang der endocytischen und trotz der Interaktion mit Lysosomen, zu verwalten Bakterien Abbau 4 zu vermeiden. Ansäuern des BCV von der vesikulären ATPase erforderlich , um die Expression des bakteriellen Typ IV – Sekretionssystem (T4SS) 5 zu induzieren. Es wird angenommen , dass bakterielle Effektoren sekretiert durch die T4SS wesentlich sind für Brucella ihrer replikativen Nische zu etablieren, da Deletion des T4SS 6 oder Hemmung der vesikulären ATPase führen zu Fehlern in der Einrichtung der intrazellularen Nische 7. Bakterien während der Phase des Handels nicht, bis sie replizieren erreichen 8 ein ER-derived vacuolar Fach. Sobald die intrazelluläre Vermehrung auftritt, wird die BCV in cl gefundenose Assoziation mit ER Marker wie Calnexin und Glucose-6-Phosphatase – 6.
Die molekularen Mechanismen , durch die Brucella Zellen eintritt, vermeidet lysosomalen Abbau und repliziert schließlich in einem ER-ähnlichen Fach bleiben weitgehend unbekannt. Wirtsfaktoren in verschiedenen Schritten der Infektion beteiligt sind vor allem durch gezielte Ansätze oder kleinem Maßstab small interfering RNA (siRNA) Bildschirm ausgeführt in Drosophila – Zellen 9 identifiziert worden. Diese haben Aufschluss über den Beitrag der einzelnen Wirtsfaktoren bei Brucella – Infektion , aber wir sind noch weit von einem umfassenden Verständnis des gesamten Prozesses.
Hier Protokolle, die die Identifizierung der menschlichen Wirtsfaktoren unter Verwendung von großen RNA-Interferenz (RNAi) Screening in Verbindung mit automatisierten Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildanalyse ermöglichen vorgestellt. Reverse siRNA-Transfektion von HeLa-Zellen durchgeführt wird als described früher 10,11 mit geringfügigen Modifikationen. Der Endpunkt – Assay deckt einen großen Teil des Brucella intrazellulären Lebenszyklus außer dem Austritt und die Infektion von benachbarten Zellen. Um die Treffer charakterisieren in den Endpunkt-Assay identifiziert, ein modifiziertes Protokoll Faktoren identifizieren, in frühen Schritte der Infektion beteiligt ist, verwendet.
Ein Brucella abortus Stamm, der konstitutiv GFP exprimiert wird für den Endpunkt – Assay verwendet , in denen Bakterien erlaubt werden Zellen für zwei Tage zu infizieren. Während dieser Zeit geben Bakterienzellen, Verkehr auf die ER-abgeleiteten replikativen Nische, und in der peri-Kernraum replizieren. Die hohen GFP-Signal kann dann verwendet werden, um zuverlässig einzelner Zellen nachzuweisen, die replizierende Bakterien enthalten.
Brucella Eintrag in einem Hochdurchsatz – Assay zu untersuchen, ist es wichtig , zwischen intra- und extrazellulären Bakterien zu unterscheiden zu können. Die hier vorgestellte Methode circumvents Differential-Antikörper-Färbung von intra- und extrazellulären Bakterien. Es basiert auf einem Brucella – Stamm zugrunde , ein Tetracyclin-induzierbaren GFP in Kombination mit konstitutiver Expression von dsRed auszudrücken. Das Vorhandensein eines konstitutiven dsRed Marker ermöglicht die Identifizierung aller Bakterien, die in der Probe vorhanden sind. GFP-Expression wird durch die Zugabe des nicht-toxischen Tetracyclin analog Anhydrotetracyclin (ATC) gleichzeitig mit der Inaktivierung von extrazellulären Bakterien durch Gentamicin (Gm) induziert. Während die Zelle undurchlässige Antibiotikum Gm extrazelluläre Bakterien tötet, kann AtC die Wirtszelle eindringen und die GFP-Expression selektiv in intrazellulären Bakterien induzieren. Dieser duale Reporter ermöglicht die robuste Trennung einzelner intrazelluläre Bakterien (GFP und dsRed Signal) von extrazellulären Bakterien (nur dsRed Signal) mit Weitfeldmikroskopie. Um nachweisbare GFP – Expression durch intrazelluläre Brucella zu erreichen haben wir festgestellt , dass 4 h Induktion durch atc führt zu einer ReliLage Signal. Ähnliche Induktionsschemata selektiv GFP in intrazellulären Bakterien exprimieren verwendet wurde zuvor intrazelluläre Shigella 12 zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacterial pathogens have evolved numerous strategies to manipulate eukaryotic host cells to their benefit. Pathogens causing acute infections often show rapid proliferation which is accompanied by significant alarming of the immune system and loss of viability of infected cells. In contrast, Brucella and other pathogens that cause chronic infections manage to establish long-lasting interactions within host cells. Therefore, bacteria need to fine tune host cell functions to their benefit without disrupting cellul…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants 51RT 0_126008 and 51RTP0_151029 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX and TargetInfectX, respectively, in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology. We acknowledge grant 310030B_149886 from the Swiss National Science Foundation (SNSF). Work of S.H.L and A.C. was supported by the International PhD Program “Fellowships for Excellence” of the Biozentrum. Simone Muntwiler is acknowledged for technical assistance. We would like to thank Dirk Bumann for providing pNF106 and Jean Celli for pJC43 and pJC44.
Materials
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used. |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 ug/ml solution in 100% ethanol is kept at -20°C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20°C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTTTTGAATTCTGGCAATTCCGACGTCTAAGAAACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTTTTGTCGACTTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10x objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20mm, DIC Prism: 10x, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1392 x 1040 imaging pixels, 6.45 x 6.45-µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25×36 |
Riferimenti
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