Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

Published: August 13, 2016 doi: 10.3791/54265
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences in Philadelphia

Introduction

Angiogenese er utløst av ekstracellulære signal signaler som fremmer endotelceller (ECS) for å polarisere, migrere med retnings spesifisitet, og danne nye blodkar i vev som krever blodtilførsel. Medvirkende faktorer som antas å drive angiogenese er signaler fra den ekstracellulære matriks (ECM). Som svar på fysiske signaler, egenkapitalbevis utvide nye grener med retnings spesifisitet for å veilede retningsbevegelse i dannelsen av det vaskulære nettverket 1,2. Arkitekturen av EC morfologi og forgrening er definert ved lokalisert regulering av mikrotubuli (MT) cytoskjelettet på en måte som er koordinert til regulering av acto-myosin kontraktilitet 3. For at EC grener for å danne, må myosin-II være lokalt nedregulert, noe som resulterer i lokaliserte membranfremspring 4. På samme tid og på samme sted i cellen, blir MT vekst dynamikk endret som resulterer i langsom og vedvarende MT vekst for å fremme gren Elonsøkelsen og stabilitet fem. Dette koordineres cytoskeletal regulering tillater egenkapitalbevis for å polarisere deres morfologi å lette retnings migrasjon.

Utviklingen av en polarisert cellemorfologi krever polarisert MT montering 6. I migrere epitelceller, MTS vokser langsomt og vedvarende spesielt ved den fremre kant av cellen 7-9; mens i nevroner, initiering og forlengelse av aksoner eller dendritter krever at MT'er ikke bare er til stede, men at de er dynamisk omgår prosessene for montering og demontering 10-15. På denne måten lokalisert kontroll av MT vekstdynamikk bestemmer arkitekturen av cellen og gir mulighet for rask ombygging av celle morfologi som egenkapitalbevis navigere gjennom deres ECM.

MT vekstdynamikk er regulert av familier av molekylære motor proteiner og ikke-motoriske proteiner, kalt microtubule assosierte proteiner eller microtubule samspill proteiner (heretter RefeRøed til kart). Kart kan lokalt aktiveres eller deaktiveres, typisk gjennom signaliserer kaskader initiert ved celle-ECM grensesnitt 16,17. Når aktiv, kart funksjon ved binding til MT og endre kinetikken MT montering og demontering; dermed fungerer til lokalt regulere MT dynamikk for å fremme celle form og polaritet 18-20. Mitotisk cent Associated kinesin (MCAK) er en kinesin-13 familien MAP som binder seg til MT ender og par ATP hydrolyse til MT demontering 21-23. Dette funksjonelle rolle av MCAK er kjent for å være kritisk i den mitotiske spindel 24-28, så vel som under interfase 29,30. Innenfor interegenkapitalbevis, er MCAK-mediert MT demontering regulert av lokaliserte Aurora-A indusert fosforylering av MCAK som svar på såret-kant indusert aktivering av Rac1 liten GTPase. Resultatet av dette signalkaskade er inhiberingen av MCAK ved den fremre kant av ECS, noe som resulterer i polarisert MT vekst mot leading kant og MCAK-indusert MT demontering i bakkant av trekkende egenkapitalbevis 31.

Tradisjonelle metoder for måling av MT vekst dynamikk har typisk anvendt hånd sporing av enten fluorescent-merkede tubulin eller, mer nylig, fluorescens-merket MT Slutt-bindende protein 1 eller 3 (EB1 eller EB3, henholdsvis). Den fluorescerende tubulin tilnærmingen har den fordelen merking hele MT array. Imidlertid, fordi de fleste av mitotiske celletyper opprettholde en radial rekke MT'er i løpet av inter 8,32,33, mts nær den sentrosomen er meget tette, og som et resultat, relativ MT vekst og demontering med fluorescerende tubulin er vanligvis begrenset til den perifere områder av cellen. På grunn av disse begrensningene, har utnyttelse av fluoresceinmerkede EB proteiner (EB1 eller EB3) vært mer felles tilnærming til måling MT dynamikk. Fordi EBS bare merke den voksende pluss-endene av MTS, vises de som små (1-3 mm), sterkt fluorescerende kommerts, og dermed gi en lett merkbar markør for MT polymerisasjon med svært begrenset bakgrunnsfluorescens 34-37. Mens det faktum at EBS etiketten bare et delsett av MT matrisen representerer en stor styrke av EB tilnærming, er det også fremhever en viktig begrensning er at ikke-voksende MT'er ikke merkes av EB3 tilnærming. Likevel, evnen til å måle og spore EB3 kometer over tid og å visualisere MT vekst innen sub-cellulære regioner gjør denne tilnærmingen ideelle for applikasjoner som krever regional evaluering av MT organisasjon.

En annen viktig begrensning av tradisjonelle metoder for måling MT vekstdynamikk har vært svært store datasett og den tiden som kreves for dataanalyse. Denne begrensningen stammer fra behovet for hånd sporing av hundrevis av EB komet med høy tidsoppløsning. Dessuten, disse målingene må gjøres i et statistisk signifikant antall celler og også utføres under en rekke forskjellige kontroll- og experimental forhold. Nylig har disse begrensningene blitt overvunnet gjennom beregningsorientert analyse teknikker spesielt rettet mot sporing EB3 kometer ved hjelp av time-lapse mikroskopi i levende celler 35. Når den brukes på riktig måte, fungerer dette beregnings tilnærming til både begrense potensialet for menneskelige feil i forbindelse med hånd-sporing i tillegg til å gi for en high-throughput metode for å måle MT polymerisasjon. Computational analyse av MT dynamikk ved hjelp av Matlab-baserte programvarepakke, plusTipTracker, åpner for målinger av MT vekst ved å spore fluorescently-merket EB3 kometer 5,31,35,38. I tillegg gir plusTipTracker programvare for beregninger av MT katastrofehendelser (aka demontering) basert på forsvinningen av EB3 kometer innenfor en voksende MT spor, og gir mulighet for sub-mobilnettet (aka regional) analyse av MT vekstdynamikk innenfor brukerdefinerte områder av interesse . For våre studier, ble MT vekstdynamikk i forhold innenforforgrenede regioner versus ikke-forgrenede regioner, eller innen ledende versus følgende cellekantene. Datautgang fra plusTipTracker programvare kan også brukes til å generere fargekodede spor overlegg for de enkelte celler og sub-cellulære regioner.

Her beskriver vi metodene som er brukt for å undersøke hvilken rolle MCAK i moduler MT vekstdynamikk og bidraget fra denne MT depolymerase til regulering av EF forgrening morfologi og retnings migrasjon. Vår tilnærming benyttes en primær human cellelinje, Human Umbilical Vein endotelceller (HUVECs), som er lette å dyrke og meget mottagelig for elektroporering-indusert, transient transfeksjon av plasmid cDNA. Vi brukte høy oppløsning, time-lapse fluorescens mikroskopi av HUVECs transfektert med MT End bindende protein 3 (EB3) og Mitotisk cent Associated kinesin (MCAK) -spesifikk cDNA konstruerer for å vurdere effekter på MT dynamikk transfektert HUVECs. PlusTipTracker-baserte beregningsbildeanalyse av EB3-merket MT pluss endene var å måle MT veksthastighet og MT vekst liv i intervallbilder, for å måle og sammenligne effekten av eksperimentelle manipulasjoner på MT vekstdynamikk. Denne metodikken gir mulighet for studier av MT dynamikk og identifisering av hvordan lokalisert regulering av MT dynamikk innen sub-cellulære regioner bidrar til angiogeneprosesser i EU forgrening og migrasjon. Disse teknikkene er aktuelt for undersøkelser av alle MAP som kan fluorescensmerkede og uttrykt i levende celler.

Protocol

1. HUVEC Kultur og vedlikehold

  1. Forbered komplett endothelial basal medium ved å tilsette hele innholdet i den endotelial cellevekst medium supplement pakke og 5% penicillin / streptomycin antibiotika blandingen til fenol rød gratis endothelial basal media (se Materiale / Utstyrsliste for detaljer). Varm fullstendig endoteliale basalmedium til 37 ° C i et vannbad.
  2. Fjerne en HUVEC kryoampulle fra flytende nitrogen lagring og tines raskt i et 37 ° C vannbad i 2 minutter. Når ~ 80-90% tint, tilsett 500 ul av fullstendig varmet endoteliale basalmedium til kryoampulle, blandes ved pipettering, og dispensere cellene jevnt inn i en 100 mm plast-vevskultur skål inneholdende 15 ml oppvarmet fullstendig endoteliale basalmedium.
  3. Plasser cellene i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Tillat celler å følge over natten. Ikke fjern eller endre cellekulturmediet.
  4. Når 100 mm fatet er> 90% sammenflytende, overføre HUVECs jegnFor en 75 cm 2 vev kultur behandlet kolbe og opprettholde ved> 60% samløpet til enhver tid (se trinn 1.5).
    Merk: Når holdes ved en tetthet> 60%, er HUVEC doblingstiden gående 18-20 timer.
    1. For situasjoner hvor aging cellene ikke er nødvendig (dvs. densiteten er <90%), aspirere mediet og erstatte med frisk fullstendig endotel basal medium hver 48. time.
  5. Når HUVECs nå> 90% samløpet, skyll 2 ganger med 10 ml 1x PBS, og deretter fjerne celler fra vev kultur tallerken ved å behandle dem 1,5 ml 0,25% trypsin for 1-2 min ved 37 ° C. Merk: Levedyktighet av HUVECs blir sterkt redusert ved å forlenge lengden av trypsin eksponering.
  6. Rednings cellene ved tilsetning av 8,5 ml komplett endoteliale basalmedium til trypsin / HUVEC blanding i et forhold på 4: 1 endoteliale basalmedier komp: trypsin (minimal forhold), og samles i et 15 ml konisk rør.
  7. Sentrifuger ved 1400 x g i 4 min. Sugsupernatanten.
  8. Resuspender pelleten i 2 ml fullstendig endoteliale basalmedium og tilsett cellene i et nytt 225 cm2 vevskultur kolbe inneholdende 25 ml komplett endoteliale basalmedium.

2. Coverslip Forberedelser Før HUVEC Culture

  1. Coating Dekk med fibronektin underlag.
    1. Forbered squeaky-clean 22 mm Antall 1.5 Dekk 39 og oppbevares ved romtemperatur (RT) i 100% etanol.
    2. Bruk en gassbrenner til å flamme en dekkglass og plassere den i en 35 mm petriskål ved hjelp av pinsett.
    3. Forbered en fibronektin / PBS blanding ved å blande 10 mL av fibronektin lager (1 mg / ml) med 990 mL PBS.
    4. Pipetter 250 mL av fibronektin / PBS blandingen på dekkglass i 35 mm parabolen. Jevnt fordelt for å dekke overflaten av dekkglass.
    5. Inkuber fatet i minimum 3 timer ved 37 ° C og skylles 3 ganger med 2 ml av 1 x PBS før bruk.
  2. dekk Activation
    1. Plasser en 22 mm No. 1.5 dekk i 50% 3-aminopropyltrimethyloxysilane i 10 min på en røre plate. Etter inkubering vaskes 10 ganger i 2 minutter hver i dobbeltdestillert H2O (DDH 2 O).
    2. Inkuber dekkglass i 0,5% glutaraldehyd i 30 min på en røreplate. Etter inkubasjon, vask 10 ganger i 2 min i DDH 2 O.
  3. polyakrylamid Forberedelse
    1. Forbered en PA gel med en compliance på 0,7 kPa (kPa) ved å tilsette 3,75 ml 40% akrylamid, 0,3 ml 2% bis-akrylamid, og 0,95 ml DDH 2 O.
    2. Forbered en 10% arbeidsløsning ammoniumpersulfat (APS) og lagre på is inntil bruk.
    3. For å forberede PA løsning for en dekkglass (totalt volum = 166,7 mL), tilsett 0,83 mL av DDH 2 O, 41,7 mL av bis-akrylamid løsning (laget i trinn 2.2.2.1), 124 pl 10% APS, og0,25 mL av TEMED.
    4. Umiddelbart pipettér 15 ul PA løsning på en hydrofob glass lysbilde (se reagenser List) og dekk med en aktivert 22 mm No. 1.5 dekkglass. Tillat den PA for å polymerisere i 20 minutter ved RT.
    5. Fjern dekkglass og overføre til en 35 mm parabolen. Vask 3 ganger med 2 ml av 1 x PBS. Lagre for <2 uker ved 4 ° C.
    6. Å binde fibronektin til polyakrylamid gel, utsett polyakrylamid-belagt Dekk til 2 mm sulfo-SANPAH med 7500 J av UV-lys (254 nm). Skyll en gang med DDH 2 O.
    7. Forbered en fibronektin / PBS blanding ved å blande 10 mL av fibronektin lager (1 mg / ml) med 990 mL PBS.
    8. Pipetter 250 ul av fibronektin / PBS blandingen på dekkglass (e) i en 35 mm petriskål. Jevnt fordelt for å dekke overflaten av dekkglass.
    9. Inkuber fatet i minimum 3 timer ved 37 ° C og skylles 3 ganger med 2 ml av 1 x PBS før bruk.
class = "jove_title"> 3. cDNA Transfeksjon og HUVEC Kultur på Coverslip

  1. Fullfør trinn 1,5-1,6.
  2. Ved hjelp av en hemocytometer, telle celle nummer og samle et volum som inneholder 100.000 celler / dekk (for ikke-migrering eksperimenter) eller 500 000 celler / dekkglass (for migrasjon eksperimenter). Pellet cellene via sentrifugering ved 1400 x g i 4 min.
    Merk: Migrasjon protokollen er beskrevet i kapittel 9 nedenfor.
  3. Resuspender celler som skal transfekteres med 100 ul buffer elektroporering. Kombiner med 1 mikrogram cDNA og fyll i electroporation kyvette. Electroporate celler: blanding DNA bruke programmet utpekt for HUVEC electroporation (f.eks program #: A-034).
  4. Rescue transfekterte celler med 500 mikroliter komplett endotelceller basal medium og plateceller på en fibronektin lakkert 22 mm No. 1.5 dekk (se protokoll 2.1 ovenfor). Inkuber ved 37 ° C i 3-4 timer for å gi tid for ekspresjon av cDNA-konstruksjoner.
le "> 4. Utarbeidelse av Specimen for Imaging

  1. Skjær dobbeltsidig tape til 2,5 cm x 0,65 cm strimler.
  2. Skaff et rent glass lysbilde. Ta to strimler av tosidige tape og fest dem horisontalt langs toppen og bunnen kanten av rasgropa. Merk: Det er viktig å tillate en liten mengde plass mellom båndet og glidekant for tetning av kammeret som beskrevet i trinn 4.5).
  3. Montere dekkglass (fra Trinn 3.4; celle siden ned), slik at 2 kanter av dekkglass hvile på båndet. Bruk pinsett til å trykke forsiktig ned for å feste dekkglass.
  4. Ved hjelp av en mikropipette, tilsett 40 mL av bildemateriale (komplett endothelial basal medium supplert med 25 mM HEPES) mellom dekkglass og lysbilde. Pass på at avstanden mellom dekkglass og lysbildet er helt fylt med bildemateriale. Aspirer overskudd av bildemateriale (om nødvendig).
  5. Forsegle alle kanter med varm VALAP (1: 1: 1 vaselin: lanolin: parafin). Sjekk for lekkasjer ved å skyve gently på dekkglass.
  6. Plasser montert og forseglet dekkglass på forvarmet (37 ° C) mikroskoptrinnet.

5. Mikroskopi

  1. Ved hjelp av en roterende disk confocal mikroskop utstyrt med en 60X, 1,40 Numerisk Aperture (NA) Differential interferens kontrast (DIC) olje nedsenking objektiv, et automatisk fokus overvåkingssystem (PFS), elektronisk lukker for overført belysning, en X-og Y motored trinn, båndpassfiltre som er plassert i et elektronisk filterhjul, og en monolittisk laser kombinator modul, fokusere mikroskopet ved grenseflaten av cellen / dekkglass og bruke objektbord spaken for å lokalisere en enkelt celle.
  2. Klikk på "Kamerainnstillinger" panel i bildet program. Innenfor "eksponeringstid" dropdown vinduet på Kamerainnstillinger-panelet velger 400 msek.
    Merk: Eksponeringstiden kan variere og bør bestemmes empirisk.
  3. Klikk på "ND Acquisition" panel iimage program. Innenfor kategorien lambda (λ) av ND Acquisition panelet, klikk på boksene for å velge 488 og 561 nm lasere. Innenfor "time" kategorien i ND Acquisition panelet satt oppkjøpet tid til to sekunder, og den totale tiden til 2 min.
  4. Klikk på "Kjør nå" -knappen i ND Acquisition panelet for å skaffe seg en 2 min time-lapse bildesekvens på 2 sek anskaffelses intervaller ved hjelp av en 400 ms eksponeringstid for både 488 og 561 nm belysning.
  5. I "Optical Config" panel av bildet programvare og bruke kamerainnstillingene som er beskrevet i trinn 5.2, klikk på 405 nm laser-knappen, og klikk deretter på "Hent" å fange et enkelt bilde av blå fluoriserende protein (BFP) -merkede proteiner .
    Merk: Det er generelt lurt å begrense celle eksponering (frekvens på bildeopptak og / eller eksponeringstid) til 405 nm laser belysning som denne bølgelengde kan skade cellene over tid.
    1. For MCAK-shRNA studier, encquire et enkelt 405 nm bildet for å verifisere uttrykk for BFP-merket shRNA.
  6. I "Optical Config" panel av bildet programvare og bruke kamerainnstillingene som er beskrevet i trinn 5.2, klikk på DIC-knappen, og klikk deretter på "Hent" å fange et enkelt DIC bilde av cellen for forgrening morfologi analyse (se avsnitt 10 , nedenfor).
  7. Etter bilde oppkjøpet, bruke "lysstyrke / kontrast" -funksjonen i bildet program til digitalt øke bildesignalet.
  8. Eksportere lysstyrke og kontrast justert bilder. Klikk på "File", deretter "Lagre som", deretter for å velge ".tif" for bildefilen type.
    Merk: Dette genererer vanligvis 61 TIF bildefiler fra en enkelt 2 min time-lapse oppkjøpet når fanget som beskrevet i trinn 5.4.

6. MT Dynamics Analysis

  1. For EB3 sporing, bruke plusTipTracker programvare 35, en åpen kildekode,Matlab-baserte beregningsprogramvarepakke utviklet for automatisk gjenkjenning, sporing, analyse og visualisering av fluorescensmerkede EBS.
  2. plusTipGetTracks Graphical User Interface (GUI)
    1. Du får tilgang til plusTipGetTracks GUI, skriv plusTipGetTracks.
    2. For EB3 komet deteksjon, bruker GUI for å bla gjennom og velge den overordnede katalogen som inneholder .tif bilder.
    3. Innenfor sporingsparametre panelet på plusTipGetTracks GUI Oppgi følgende verdier: Søk Range Radius = 5-10; Minimum Sub-Track Lengde = 3; Max Gap Lengde (Frames) = 12; Max Svinn Factor = 1,0; Maksimal vinkel forover = 25; Maksimal vinkel bakover = 10; Svingninger Radius (piksler) = 2; Frame Rate (sek) = 2; Pikselstørrelse (mm) = 110.
      Merk: sjekk først for optimale sporingsparametre som bruker plusTipParamSweepGUI på et representativt sett av .tif bildefiler. Den angitte for pikselstørrelse verdi er spesifikk for objektiv brukes til å erverve time-lapse bildes (se trinn 5,1-5,2 ovenfor).
    4. For Region of Interest (ROI) utvalg, lage binære masker av hele cellen ved manuelt å spore cellen kant med DIC bilde av cellen for å danne et polygon.
    5. For Under Region of Interest (sub-ROI) utvalg, skape ledende og bakkant masker ved manuelt å tegne en 2 punkt tykk linje over såret ende celle av interesse å bruke en modifisert plusTipTracker sub-ROI markeringsverktøy.
      Merk: Linjen bør trekkes parallelt med sår kanten i posisjonen hvor cellen av interesse strekker seg utover nabo såret ende celler 31.
  3. plusTipSeeTracks GUI
    1. Kontroller og visuelt inspisere spor overlegg av .tif bilder lagret i "ROI" -mappen ved å klikke på "Plot Tracks" -knappen i Spor overlegg kolonnen. Gjenta for alle spor overlegg.
    2. Utføre data gruppering ved å klikke på "Opprett grupper" -knappen i Valgfrie innstillinger kolonnen. Velg experimental data som tilhører samme datasettet ved å klikke på datafiler. Lagre valget ved å gi "gruppe", et navn som lett kan identifiseres (for eksempel "kontrollgruppe").
    3. For Under ROI MT vekstdynamikk målinger, angir minimum antall bilderammer som en EB3 kometen spor må registreres innen sub-ROI for å kvalifisere som en "track" og pakke MT vekst utflukter i fremre og bakre kant ROI ved å klikke på "manuelt valg" innenfor "Sub-Rois" panel av GUI.
      Merk: For eksempel bruke 3 rammer (6 sek) som minimum deteksjon lengde for å bli trukket ut som en "spor". Hentet låter fra sub-Rois er lagret i et delprosjekt mappen i den opprinnelige ROI mappe for hver celle.
    4. MT vekst sub-spor og undergruppe analyse
      1. Beregn middelverdien MT veksten fart og mener MT vekst levetid for "gruppe" datasett (se trinn 6.3.2), for hver ROI (se step 6.2.4), og for hver under ROI (se trinn 6.2.5).
    5. Innenfor Quadrant Scatter Tomter kolonne i plusTipSeeTracks GUI, klikk på "Velg Grupper" og klikk på grupper (opprettet i trinn 6.3.2) som skal sammenlignes.
      1. Velg "Growth speed" for x-aksen og skriver gjennomsnittsverdien for vekst hastighet (fra trinn 6.3.4) inn i boksen. Velg "Growth levetid" for y-aksen og skriver gjennomsnittsverdien for vekst levetid (fra trinn 6.3.4) inn i boksen.
    6. Merk av i boksen ved siden av "Fjern spor på start / end" og ved siden av "Batch prosess på grupper." Klikk på "Make Tomter" for å generere en fordelingsprofil for MT vekstspor for hele cellen, forkanter, og bakkanten sub-Rois.
      Merk: For studier som er beskrevet her, er MT vekst spor fordelt i fire delpopulasjoner: langsom og kortvarig, treg og lang levetid, rask og kortvarig, og rask og lang levetid.
    7. Klikk på "Data", og klikk deretter på "Data Analysis" fra Datadropdown vinduet. Velg "t-test: to sample forutsatt lik avvik" for å sammenligne bety MT veksthastighet og MT vekst levetid. Markere dataceller innenfor arket hvor t-test-sammenligning resulterer i en p-verdi på <0,001.

7. colocalization Analysis

  1. For bakgrunn subtraksjon, ved hjelp av "line verktøy" av bildeprogram, tegne en region av interesse (ROI) ved å klikke på skjermen for å opprette en firkantet form som er 10 mikrometer to på den grønne kanalen bilde (488 nm eksitasjon) på en stilling hvor det ikke er noen celle fluorescens (bakgrunnen). Gjenta dette for den røde kanalen bilde (561 nm eksitasjon) ved hjelp av bildene fra trinn 5.8.
  2. Bruk av bildebehandlingsprogrammer prseismogrammet, høyreklikk på ROI fra trinn 7.1 og velg "satt som bakgrunn ROI." Klikk på "Image", klikk på "Trekk bakgrunn" fra dropdown vinduet for å trekke den gjennomsnittlige bakgrunnsverdier (fra trinn 7.1) fra hele bilde. Utfør bakgrunn subtraksjon for celler co-uttrykker Em-Aurora A og enten mCherry-MCAK, Mapple-EB3, eller Mapple-tubulin.
  3. I bakgrunnen trekkes røde kanalen bare bilde, klikk på Binary bånd og velg "Define Threshold" og velg deretter "per kanal" -funksjonen for å utelukke den utpekte fluoriserende fargestoff.
    Merk: thresholding trinnet ble utført på enten mCherry-MCAK, Mapple-EB3, eller Mapple-tubulin bildet for å tillate tegne linjer som spesifikt markerte terskel gjenstand for samlokalisering analyse (se trinn 7.4).
  4. Ved hjelp av linjen verktøy i bildebehandlingsprogrammer, tegne en to-punkts tykk linje over de ekskluderte objekter innenfor terskel bildet.
  5. Velg linjen objekter trekkes i trinn 7.4. Kopier og lim linjen objekter fra den røde kanalen på den tilsvarende grønne kanalen (Em-Aurora A) bilde.
  6. Mål gråtone pikselintensitetsverdiene under linjen objekter å beregne samlokalisering og totale Em-Aurora-A-verdier for hver enkelt celle ved å velge "Measure" og deretter "Intensitet Profil" fra rullegardinvinduet i bildeprogram.
    1. Organiser dataene etter eksperimentell behandling og sub-cellulære regionen ved å eksportere til et regneark program, og lagre filen som type .xls (for eksempel "control_grayscale_intensity.xls").
      Merk: Data presentert på denne måten representerer det ko-lokalisering brøkdel av den totale målte Em-Aurora-A per sub-cellulære region.
  7. Ved hjelp av de målte verdiene fra trinn 7.6, gjenta trinn 6.3.7 for å beregne statistisk signifikans ved hjelp av p <0,05 som cutoff for betydning.
  1. Fix celler (se trinn 3.4) med paraformaldehyde / glutaraldehyd co-utvinning / fiksering buffer (PGF-cefem, 4% paraformaldehyde, 0,15% glutaraldehyd, 0,2% vaskemiddel i 60 mm rør, 27,3 mm HEPES, 10 mM EGTA og 8,2 mM MgSO 4, pH 7,0) i 10 minutter ved RT.
  2. Skyll 3 ganger i 5 minutter med 2 ml av 1 x PBS.
  3. Behandle 2 ganger i 15 min med 0,01 g / ml NaBH4 i 1 x PBS for å slukke reaktive aldehyder.
    Merk: NaBH4 former bobler som kan føre til Dekk å flyte. Det er viktig at glassene være neddykket i løpet av disse inkubasjoner. Hvis glassene begynner å flyte Bruk pinsett til å løfte en kant av dekkglasset, slik at det bobler å unnslippe.
  4. Skylle 2 ganger med 1 x PBS før blokkering med 5% fettfri melk i 1 x PBS på en gyngende plattform i 1 time ved RT.
  5. Inkuber celler i primære antistoffer (kanin anti-pT288-Aurora A (1: 1000)) og rotte anti-α-tubulin (1: 500) fremstilt i 1 x PBS-oppløsning. Inkuber ved 4 ° C på en risteplattform over natten.
  6. Fjern primære antistoffer og skyll 3 ganger for 5 min i 1x PBS før inkubasjon med sekundære antistoffer (esel anti-kanin (1: 1000) og geit anti-rotte (1: 1000)) utarbeidet i 5% fettfri melk for 2 timer ved 37 ° C.
  7. Mount dekkglass på et objektglass i fluorescens-optimalisert montering medium. Tett dekkglass kantene til lysbildet bruker klar neglelakk, og oppbevares mørkt ved 4 ° C.

9. celle migrasjon analysen

  1. Utfør HUVEC kultur for migrasjonsanalyser som beskrevet ovenfor (protokoll 3: cDNA Transfeksjon og HUVEC Kultur på Coverslip, trinnene 3,2-3,3).
  2. Etter celle transfeksjon, rednings transfekterte celler med 80 mL komplett endothelial basal medium. Pipetter 80 mL prøve som en eneste dråpe på midten av en tørket fibronektin belagt 22 mm runde nr 1,5 dekkglass. Ikke spre 80 mL DROs. Inkuber ved 37 ° C i 3-4 timer for å gi tid for celle tilslutning til et sammenflytende monolag.
    Merk: Tørking av dekkglass som er nødvendig for å hindre at 80 ul dråpe fra å spre seg ved kontakt med dekkglass. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for HUVECs å være konsentrert i et lite område av dekkglass og derved fremmer rask dannelse av et konfluent monolag av celler.
  3. Skyll 2 ganger i fullstendig endothelial basal medium for å fjerne un-tilkoblede celler.
  4. For å lage en "sår kant," skrape dekkglass med en sterilisert barberblad ved å forsiktig dra en ren barberblad over HUVEC monolaget (fra trinn 9.2). Hold dekkglass forsiktig på plass med tang for å hindre glidning av barberblad under skraping.
  5. La cellene for å utvinne i en 37 ° C inkubator i 3 timer. Montere og montere dekkglass (er) for imaging (se protokoll 4).
  6. Acquire fase-kontrast og 488 nm bilder med 10 minutters intervaller i 12 timer på mikroskopet ved hjelp av en10x 0,45 NA fase objektiv og en 0,52 NA LWD kondensatoren ved hjelp av "ND Acquisition" panel av bildet oppkjøpet programmet (beskrevet i trinn 5.3).

10. Kvantifisering av HUVEC Forgrening og migrasjon

  1. For forgrening analyse og for å tillate enda celle belysning og objektiv kvantifisering, få en mikroskopisk bilde av en HUVEC transfektert (se trinn 3.3) og uttrykker Mapple-C1 cDNA konstruere, en celle volum markør.
  2. Bruke bildeprogram, åpner Mapple-C1 bilde og merke posisjonen på begge sider av den grenen hvor den største vinkelen på kurvatur membranen viser. Koble de to punktene med en rett linje. Denne linjen er "grenen opprinnelse."
  3. Ved hjelp av linjeverktøyet av bildebehandlingsprogrammer, visuelt identifisere grener som måler> 10 mikrometer i lengde fra "gren opprinnelse" ble bestemt i punkt 10.2. Beregn gren lengden ved å måle avstanden fra the "gren opprinnelse" til den mest distale punktet av grenen spissen (se figur 4).
  4. Tell antall forgrenede fremspring som måler> 10 um i lengde for å oppnå "celle avdelingsnummer."
  5. For migrering analyse, ved hjelp av bilder fanget i trinn 9.6, visuelt identifisere et sår-kant HUVEC basert på fysisk (dvs. celler fysisk på kanten av såret) og ekspresjon profil (dvs. velge en grønn sår kant celle hvis eksperimentet innebærer ekspresjon av GFP).
  6. Ved hjelp av fasekontrastbilder av cellen, visuelt identifisere kjernen (den semi-transparent sfærisk struktur nær midten av cellen), og deretter visuelt identifisere kjerne (en liten, mørkfarget, sfærisk struktur i kjernen) ved første gang poenget med time-lapse bilder. Klikk på posisjonen til nucleolus å merke x og y koordinatene til nucleolus.
  7. Ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer, hånd sporenucleolus i påfølgende time-lapse bilder ved å klikke på plasseringen av nucleolus å merke x og y koordinatene til nucleolus i hver ramme av time-lapse film (figur 4).
  8. Ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer, klikk på "File" og klikk deretter på Lagre som "klikk deretter for å velge bildefilen type" XLS. "
  9. Åpne hånd sporing datafil (fra trinn 10.8) ved hjelp av et regnearkprogram. Beregn middelverdien migrasjon hastighet og bety migrasjon avstand til opprinnelse.
  10. Ved hjelp av et regneark program, klikk på "Data", og klikk deretter på "Data Analysis" fra rullegardinvinduet data. Velge Bonferroni-korrigert, en-veis analyse av varians test med> 95% sikkerhet som grenseverdien for statistisk signifikans.

Representative Results

HUVEC kultur for live-celle mikroskopi
Levende celler avbildning av HUVECs som uttrykker fluorescerende proteiner krever at HUVECs blir opprettholdt i et miljø som er egnet for normal cellevekst og vedlikehold, så vel som normal protein ekspresjon og funksjon. Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av protokollen som brukes for å fremstille en bufret og lukket system som opprettholder optimalisert optiske egenskaper for å samle tid-lapse bilder av levende celler. Tynne strimler av dobbeltsidig teip er plassert på et objektglass (figur 1A), og deretter dekkglass inneholdende dyrkede HUVECs er snudd på toppen av båndet, slik at cellene er vendt mot sleiden (figur 1B). På denne måten gir båndet et lite gap mellom de to glassflater, og skaper et rom i hvilket cellene kan bli badet i passende cellekulturmedium (figur 1C, se protokoll 4, ovenfor). Jegna avsluttende trinn, er det glass dekkglass forseglet til objektglasset ved hjelp av en vaselin: lanolin: parafinvoks (1: 1: 1 blanding, VALAP; figur 1D) for å etablere et lukket system. Dette cellekultur tilnærmingen ble anvendt for både den kortere tidssekvens avbildning av EB3 kometer og for lengre tidssekvens forgrening og migrasjons eksperimenter. I tillegg er den voksaktig konsistens av VALAP muliggjør enkel fjerning av objektglasset og dekk ved enden av en avbildning eksperimentere slik at supplerende tilnærminger inkludert fiksering og immunomerking (se Protocol 8), kan utføres på den samme dekkglass og celleprøve som ble visualisert ved hjelp av live-cell imaging tilnærming.

Figur 1
Figur 1:. Methodology av HUVEC kultur for live-cell mikroskopisk bildebehandling (A) Klipp 2 deler av dobbeltsidig tape til 0,65 cm x 2.50 cm rektangulære strimler og sikre ett stykke dobbeltsidig tape horisontalt langs den øvre kanten av raset, og den andre delen, langs den nederste kanten av rasgropa. Det er viktig for å tillate en liten mengde plass mellom båndet og glidekant for tetning av kammeret som beskrevet i (D). (B) Bruk pinsett fjerne dekkglass som inneholder HUVECs og invertere dekkglass (celle side ned) på toppen av bitene av tape. (C) Ved hjelp av en mikropipette, tilsett 40 ul bildemedier (komplett endothelial basal medium supplert med 25 mM HEPES) mellom dekkglass og glass lysbilde. Pass på at avstanden mellom dekkglass og lysbildet er helt fylt med bildemateriale og unngå bobler. Bruke en aspirator langs kanten av dekkglass for å fjerne overskudd av mediet, om nødvendig. (D) Bruk varm VALAP (1: 1: 1 vaselin: lanolin: parafin) for å tette rundt kantene av dekkglass. Sjekk for bildemedier lekkasjes ved å trykke rundt forsiktig på dekkglass. Bruk ekstra VALAP å rette opp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Automatisert sporing av fluorescens-merket EB3 åpner for omfattende analyse av hele cellen og regionale MT vekstdynamikk. Samlingen av klare, distinkte, og meget tid og rom-løst mikroskopiske bilder av EB3-proteinet er viktig for analyse av EB3 bevegelser innen cellen. HUVEC ekspresjon av fluorescens-merket EB3 varierer sterkt fra celle til celle og fluorescens-intensitet øker vanligvis innenfor den samme cellen over en periode på timer. Derfor er det viktig å vurdere og følge opp disse endringene i uttrykket profil for å identifisere mulige virkninger av økt EB uttrykk på MT vekstdynamikk. Dette oppnås best ved å evaluere grå-skala fluorescens intensiteteny profiler for hver avbildes celle, og deretter begrense dataanalyse til de cellene som viser et definert område av grå-skala uttrykk profiler. er innledende evaluering av uttrykket profil datasett kritisk, og bør sammenlignes med MT vekstdynamikkdata som er oppnådd ved plusTipTracker programvare for hver celle. Ekspresjonsprofiler kan plottes mot MT veksthastighet og MT vekst levetid for hver celle innenfor en eksperimentell gruppe, for å bestemme det ønskede område av grå-skala ekspresjon og for å identifisere potensielle utliggere.

Figur 2 høydepunkter en HUVEC dyrket på en fibronektin underlag (se protokoll 2.1 ovenfor) og uttrykker nær optimale nivåer av Mapple-merket EB3. Fluorescent EB3 kometer er vist i en time-lapse serie med bilder over en periode på 12 sek (figur 2A). Analyse av EB3 kometer ved hjelp plusTipTracker programvare innebærer en automatisert, frame-by-frame EB3 komet DeteDette skjer (grønne og gule prikker, figur 2B). Comets oppdaget innenfor hver ramme blir da knyttet, avhengig av deres endring i posisjon fra ramme-til-ramme, for å generere EB3 spor og en visuell EB3 spor overlegg (figur 2C-F). Spor overlegg er fargekodet og fargeskiller kan bestemmes av parametre oppgitt av brukeren. Vanligvis er disse skillene bruke det globale gjennomsnittet av MT vekst fart og MT vekst levetid 5,31 og dermed dele dataene inn i fire grupper: langsom og kortvarig (rød), langsomme og langlivede (gule), raske og kort- levd (grønn), og rask og langlivede MT vekst (blå, figur 2G). PlusTipTracker-mediert sporing av EB3-merket MT vekstdynamikk gjør også brukerdefinerte områder av interesse (Rois). PlusTipTracker trekker ut MT vekst spordata fra innenfor brukerdefinert ROI (figur 2A, B og F), og dermed åpner for sammenligninger av MT vekst Dynamics innen ulike områder av den samme celle.

Figur 2
Figur 2: EB3 kometen deteksjon, sporing og plusTipTracker data utgang (A) time-lapse film fra en HUVEC uttrykke Mapple EB3.. Venstre panel viser en hel celle utsikt og hele cellen maske (hvit linje) demarking cellegrensene. Rød boks representerer det forstørrede området vist i time-lapse bilder (høyre panel). Høyre panel viser rå grå-skala time-lapse bilder av EB3 kometer i suksessive bilderammer (t = 0 sek - t = 12 sek). (B) plusTipTracker påvisning av EB3 kometer fra bildene som vises i (A). Venstre panel viser en hel celle utsikt over oppdagede kometer (gule prikker). Rød boks representerer det forstørrede området vist i time-lapse bilder (høyre panel). Høyre paneler markere fem oppdaget EB3 kometer (røde piler) og spore disse fem kometer over 12 sek bildebehandling periode. Grønn prikker representerer oppdaget EB3 kometer som ikke eksisterer (eller ble ikke oppdaget) i forrige tidsintervall. (C) Maksimal intensitet projeksjon av 61 rammer (2 min film) av EB3 komet vist i (A). (D) plusTipTracker MT spor overlegg av de samme 61 bildene (2 min film) som vises i (C). (E) Zoom av maksimal intensitet projeksjon (rød boks i C). (F) Zoom av plusTipTracker MT spor overlegg av maksimal intensitet projeksjon (rød boks i D). (G) Fargekodede legende for spor overlegg vist i (D) og (F). Betegnelse så sakte, rask, kortvarig eller langlivet er basert på gjennomsnittsverdien for alle vekst spor målt i en gruppe på ti Mapple-EB3 uttrykker HUVECs. For lettere visualiseringen, blir spor overlegg i (D) og (F) genereres ved hjelp av inverterte bildeelementintensitetene av cellebildet vist i (A). Skala barer = 20 mikrometer./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

HUVEC forgrening og vandringsmønster er følsomme for Mekano-fysiske signaler fra ECM.

HUVECs er vel kjent for å reagere på ulike typer av signalerings signaler og ved å gjøre dette, for å gjennomgå morfologiske endringer som dikterer en hensiktsmessig cellulær respons til den bestemte signal signalet (e) 36,40-42. HUVECs dyrket på fibronektin belagt glass underlag (figur 3a), eller på stive to-dimensjonale polyakrylamidprodukter ECM (55 kPa) viser vanligvis en runde eller avlange morfologi med noen distinkte forgrenede fremspring (Figur 3B). Imidlertid, når de dyrkes på meget myke to-dimensjonale polyakrylamid ECM (0,7 kPa), HUVECs viser en sterkt forgrenet morfologi som er kjent for å resultere fra compliance-indusert nedregulering av myosin-II kontraktilitet 4,5,31 (Figur 3C). Dermed HUVECs regulere mobilnettet morfologi gjennom ECM mechanosensing, og dette oppnås gjennom lokal modulering av MT dynamikk og acto-myosin kontraktilitet.

Fordi HUVECs vise et bredt spekter av morfologiske egenskaper, for å måle HUVEC forgrening er det viktig først å definere hva en forgrenet fremspring er, og deretter for å definere hvordan en forgrenet fremspring skal måles objektivt. En teknikk benytter en fire-trinns metode ved hvilken en cellegrense eller "maske" genereres ved for hånd å spore kantene av cellen ved hjelp av et bilde av en celle som uttrykker en fluoriserende markør volum for å definere cellekantene (figur 3D). Etter maske generasjon, er grenen opprinnelsen defineres ved å finne størst vinkel krumning mellom de forgrenede fremspringet og cellelegemet. En linje er trukket til Demark den "grenen opprinnelse" (lilla vinklede linjene, figur 3E). Avdelingsnummer måles ganske enkelt ved å telle antall grener med en definert gren opprinnelse (figur 3F). Gren lengde er målt som avstanden fra grenen opphav til den fjerntliggende gren spissen (figur 3G). For å unngå inklusjon av små lamellipodial anslag fra dataanalyse tilleggskriterium forutsetter at grenene må være lengre ( "-grenen lengde") enn de er brede (ved "-grenen opprinnelse"), og at grenene må være minst ti mikrometer i lengde 5 , 31.

Figur 3
Fig. 3: Analyse av HUVEC forgrening morfologi (A - C) DIC bilde eksempler på HUVECs dyrket på fibronectin belagte glass ECM (A) stiv (55 kPa) polyakrylamid ECM (B) og myke (0,7kPa) polyakrylamid-ECM-er (c). Forgrening øker dramatisk i HUVECs dyrket på 0,7 kPa polyakrylamid ECM (C) sammenlignet med stivere ECM (A, B). (D). DIC mikroskopisk bilde (venstre bilde) av en transfektert HUVEC uttrykker en Mapple-C1 cDNA konstruere (en celle volum markør, høyre bilde). (E) Definer gren opprinnelse ved å finne den største vinkelen på kurvatur (dvs. posisjon hvor membranen viser størst krumning, lilla-fargede linjer) på hver side av grenen og deretter koble vinklene med en rett linje (blå linje) . (F) identifisere og velge forgrenede fremspring som strekker seg> 10 um fra den "-grenen opprinnelse" (definert i E). Tell antall forgrenede utstikkere for å få "gren nummer." (G) Mål avstanden fra midten av "-grenen opprinnelse" til most distal poeng av grenen bruker linjen verktøyet i merknader og målinger anvendelse av NIS Elements programvare for å få tak i "grenen lengde." Skala barer = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I tillegg til sensing ECM compliance, HUVECs også sanse og svare på eliminering av tilstøtende cellulære kontakter som induseres av grunnen såret. I migrasjonsanalysen, HUVECs dyrket i et monolag blir utsatt for en ripe sår og migreringsegenskaper blir målt (se protokoll 9, ovenfor). Etter induksjon av såret ved å skrape den monolayer, såret bryt HUVECs polarisere ved å utvikle en protrusive ledende kant som strekker seg inn i såret (Figur 4A, t = 0 timer). Over en tid løpet av 10-12 timer, polariserte sår bryt HUVECs migrere inn i såret området og fyllesår, å etablere en ny konfluent monolag (figur 4A, t = 11 timer). Som med HUVEC forgrening, foreslår nåværende bevis for at polariseringen og migrasjon er kritisk avhengig av koordinert re-organisering av MT og aktin cytoskeletons 43-49. Dette oppnås blant annet gjennom lokalisert hemming av MCAK-indusert MT demontering i forkant, men ikke på den bakre kanten av såret kant HUVECs 31. Sensitiviteten av MT dynamikk til sår-indusert polarisasjon er initiert av Rac1 GTPase, som retter seg mot en rekke nedstrømsregulatorproteiner, inkludert Aurora-A kinase som fosforylerer og inhiberer MCAK ved den fremre kant, og andre kinaser som er i stand til å inhibere eller aktivere MAPs til lokalt modulere MT vekst og krymping 18,31,36,48,50-53. Omfattende eksperimentelle bevis støtter tanken om at koordinering av ledende protrusion og bakkant sammentrekning styres gjennom sykluser av Rac1 aktiveringå fremme MT montering i forkant og RhoA aktivering til acto-myosin kontraktilitet i bakkant, dermed kjører rettet motilitet 9,41,51,52,54-58.

Til dags dato er det ikke en etablert metodikk for å utføre automatisert sporing av celle migrasjon. Dette er et resultat av problemer i beregnings analysere celle ECM grenser som er konsekvent endring som sår ende celler polarisere og migrere. Mens mange programmer er i stand til å spore fluorescensmerkede celler 59-64, befolkningen i fluorescensmerkede HUVECs i såret ende migrasjon eksperimenter er ca 30-40% av den totale HUVEC befolkningen, og derfor flertallet av sår ende celler må visualiseres ved fase-kontrast eller DIC bildebehandling. I tillegg er det viktig ved måling av sår-kant migrering for å evaluere fluorescerende og ikke-fluorescerende celler innenfor samme såret for å identifisere spesifikkeffekter av uttrykk konstruerer både innenfor eksperimentelle studiegrupper og mellom eksperimentelle studiegrupper. For tiden er den beste tilnærmingen for å måle HUVEC migrasjon er å bruke en hånd relativ tilnærming der et sår-kant celle er først identifisert og deretter kjernen og kjerne er identifisert (figur 4B). Den kjerne er brukt som determinant stilling for sporing celle på grunn av høy lysspredning tetthet og forholdsvis liten størrelse. Disse to funksjoner av kjerne gjør det lettere å identifisere og redusere målefeil ved å begrense området hvor brukeren kan plassere de enkelte skinneposisjoner. HUVEC migrasjon sporene er så genereres ved å klikke på nucleolus i påfølgende time-lapse bilderammer. Til slutt blir migreringshastighet og migrering avstand til opprinnelsen målt og analysert med hensyn til kontroll og eksperimentelle cellegrupper (Figur 4B).

Figur 4 Figur 4: Analyse av sår bryt HUVECs og migrasjon tracking (A) 20X fase kontrast av en 11 timers time-lapse imaging serie scratch sår-edge HUVECs (aka "Migration analyse").. Såret og retning av migrasjon er indikert i panel t = 0 timer. HUVECs er vist å krysse såret-kant og forkant i såret til et monolag av celler som er dannet (t = 3,5 timer - t = 11 timer). (B) Analyse av migrasjon analysen tid lapse imaging (som vist i A) krever først identifisering av en sporbar sår-edge HUVEC basert på celleplassering (dvs. celler fysisk på kanten av såret) og uttrykk profil (jeg .e. velg en grønn såret kanten celle hvis forsøket innebærer uttrykket av GFP). Bruke fase kontrast, identifisere kjernen og kjerne. Hånd spore nucleolus i påfølgende time-lapse bilder ved hjelp av ennotasjoner og målinger søknad i NIS Elements programvare for å bestemme migrasjon hastighet og avstand til opprinnelse. Skala barer = 100 mikrometer (A), 20 mikrometer (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Bruke HUVECs i morfologi og migrering eksperimenter.
Levende-cell imaging av EB3-merket MT vekstdynamikk innenfor HUVECs krever egnede og reproduserbare celledyrkningsforhold for å måle og vurdere endringer i MT vekst og HUVEC morfologi, slik at de kan da bli tildelt en ECM signale kø. HUVECs representerer en utmerket modell for å studere celleform og bevegelighet. De er svært mottagelig for transfeksjon med fluoresceinmerkede cDNA, de utviser dramatiske morfologier som reaksjon på både oppløselige og fysiske signal signaler, og de ​​opprettholde evnen til å organisere seg i vaskulære rør når tilgjengelig egnede celledyrkningsbetingelser 65-70. Primære cellekulturer, for eksempel HUVECs, krever forsiktig håndtering og kontroll av celle passasje nummer for å sikre at cellene er friske, og at de vil oppføre seg normalt under eksperimentering. For eksempel når gjennomføre eksperimenter som undersøker cytoskeleton og / eller cellemorfologi, HUVECs bør ikke brukes til eksperimenter utover den tiende cellekultur passasje, som HUVECs begynner vanligvis å vise ikke-uniforme morfologier rundt passasje tolv til femten.

Celletetthet er også en viktig regulator av HUVEC helse og proliferasjon. HUVEC forgrening undersøkelser (se protokoll 10/1 til 10/4, ovenfor) bruke celletetthetskulturer med relativt lav for å gi cellene fysisk rom til å interagere med sin ECM og for å forlenge forgrenede fremspring. I motsetning til i såret ende migrasjonsstudier (se protokoll 10.05 til 10.08), HUVECs er kultur i en mono før såret. Som sådan, sår bryt HUVECs vise et relativt un-forgrenet morfologi, utvide ledende kantfremspring, og viser celle-celle interaksjoner med sine nærmeste naboer som de vandrer inn i såret.

Advarsler og Fordeler av Spore MT Dynamics i stue HUVECs.
Spinning disk mikroskopi er en utmerket måte åteste eksperimentelle hypoteser som krever konfokal bildeklarhet med høy tidsoppløsning. Med det passende kamera og laser-modul, er denne tilnærmingen mikros følsomme for lav emisjon fluorescens og kan hjelpe til med redusert fotobleking i forhold til andre typer av fluorescens mikroskopi. Viktigere er denne tilnærmingen også godt egnet for moderat til høy tidsoppløsning avbildning som er nødvendig for å generere omfattende målinger av MT vekst dynamikk ved hjelp av EB3 merking tilnærming, i en rekke forskjellige celletyper.

Mens EB3 metodikken for merking voksende MT pluss-endene har klare fordeler fremfor andre fremgangsmåter for fluorescerende merking MTS, har det også spesielle ulemper. For eksempel er det en del av MT tabellen som ikke aktivt vokser til enhver tid, inkludert både befolkningen i demontering MTS og befolkningen i stabile, ikke-dynamiske MTS 71-74. EB3 ville ikke merke disse to populasjoner av MTS ogderfor bidraget fra disse to populasjonene ikke ville bli inkludert i eksperimentelle dataanalyse. Alternative metoder for å evaluere hele MT utvalg har fokusert på uttrykk for fluorescens-merket tubulin, som inkorporerer i alle bestander av MTS og muliggjør identifisering av vekst, krymper, og stabil MTS. Men på grunn av den relativt høye tetthet av MT matrisen nær sentrum av cellen og ved siden av mikrotubuli organiserende senter (MTOC), merking av hele MT matrisen danner en ulempe i å utføre bildeanalyse på MT-ender som ikke er i nærheten av cellen periferien 75-77. Eksperimenter med to farger co-merking av MTS med fluorescerende tubulin og fluorescerende EB3 i levende celler har avslørt, kvalitativt, at det store flertallet av tubulin-merket MTS er også EB3-merket 78. I tillegg har det ikke vært en effektiv metode for automatisk sporing av MT'er merket med fluorescerende tubulin. Dette betyr at data som innkrevingsjon og målinger av MT dynamikk i celler som uttrykker fluorescerende tubulin krever hånd sporing av enkelt MTS, en prosess som er feilutsatt og langtekkelig. Som et resultat, har automatisert matematisk analyse av EB3-merket MTS blitt den foretrukne metode for måling av MT dynamikk som den kan anvendes på MT dynamiske forsøk på tvers av en rekke celletyper og innenfor en rekke eksperimentelle regimer 35,79.

Linking MT Vekst Dynamics til HUVEC Morfologi og migrasjon.
Fra perspektivet til en cytoskeletal etterforsker, en svært nyttig tilpasning av plusTipTracker automatisert sporing analyse er muligheten til å måle og vurdere både fullcelle og regionale endringer i MT vekstdynamikk. Kravet for en celle for å bli polarisert er en viktig forutsetning for retningscellemigrering. Som sådan, polariserte signal signaler har lenge vært kjent som nøkkelfaktorer for kjøreretningscellemigrering 30,31,51,54,56,80,81 2,82-87. I tillegg, som svar på fysiske interaksjoner med ECM (for eksempel, compliance og dimensjonalitet mechanosensing), HUVECs modulere sine MT dynamikk av lokalt regulere Maps for å fremme MT vekst innen elongating forgrenede fremspring, og dette tjener til å HUVEC migrasjon i retning av cue 5,31,88. Dermed polarisering i respons til ekstracellulære signal signaler streker behovet for eksperimentell evaluering av lokaliserte endringer i cytoskeletal dynamikk.

Samtidig levende celle avbildning av MT vekstdynamikk (ved hjelp av EB3 tilnærming) og HUVEC celle migrasjon er ekstremt vanskelig å utføre fordi MTS vokse på en tidsskala på sekunder, mens endringer i celle morfologi og retnings migrasjon forekommer på en tidsskala på timer. Likevel begge prosessene er nært Linked. Videre, kontinuerlig, hurtig avbildning av fluorescens-merket EB3 på den andre tidsskalaen fører til fotobleking av EB3-signalet. Forsøk på å løse dette problemet ved å gjennomføre korte bilde serie EB3 (1-2 min oppkjøpet serien) hvert 30. minutt har vært vellykket, men kan bare oppnås i et lite antall egenkapitalbevis som hadde optimalt uttrykk for EB3 og som ikke viser negativ effekter til gjentatte laserbelysning fem.

En alternativ tilnærming som gjør det mulig for tolkninger av hvordan MT vekstdynamikken bidra til endringer i celle morfologi og migrasjon er plusTipTracker aktuelle området (ROI) verktøyet 35 (se Protocol 6.6). Denne metodikken gir mulighet for hele cellen MT vekst sporer til å være delt inn i brukerdefinerte områder, der MT vekst spor kan da bli hentet og analysert. For eksempel, er sammenligninger av "forgrenet" versus "ikke-forgrenede" områder av cellen viste at MT'er gror mer sringe og mer vedvarende innenfor forgrenede områder sammenlignet med ikke-forgrenet celle periferi 5. I polarisert såret bryt HUVECs, sammenligninger av de ledende kant og bakkanten MT vekstdynamikk avslørte at MCAK-indusert MT demontering hemmes spesifikt i forkant, men ikke bakkanten. Regional evaluering av fremre og bakre kant MT vekst dynamikk i HUVECs som uttrykker Rac1 og / eller fosforylering mutanter av MCAK videre avslørt at Rac1-indusert aktivering av Aurora-A kinase spesifikt og lokalt inhiberer MCAK aktivitet i forkanten for å drive HUVEC polarisasjon og retnings migrasjon 31. Dermed har kombinasjonen av automatisert sporing av MT vekstdynamikk og regional evaluering av MT vekstdynamikk innenfor de forgrenede fremspring og / eller i forkant av sår-edge HUVECs mulig for oss å knytte MT vekstdynamikken til HUVEC morfologi og migrasjon.

Protokollene som beskrives er designed for å gi et generelt grei og svært repeterbare metodikk for HUVEC kultur og eksperimentell undersøkelse. Ikke desto mindre er mange av de protokollen detaljene er komplisert og tidkrevende, noe som i sin tur gir mulighet for feil eller vanskeligheter med å gjennomføre den eksperimentelle metode. Selv om det ble forsøkt å løse potensielle problemer i hele protokollen, her er gitt ytterligere, detaljert feilsøking av potensielle problemer som er mindre vanlig eller på annen måte forkortet til notater innenfor metodikk protokoller.

Relatert til belegg dekk med polyakrylamid-substrater (2,2 Protocol), et vanlig problem som oppstår er den komplekse natur av aktiverende dekkglass, kobling av polyakrylamid til glasset, aktivere polyakrylamid, og deretter kobling av ECM til polyakrylamid. En spesielt vanskelig og potensielt problematisk trinnet er å dyrke HUVECs på fibronektin / polyakrylamidgel etter eksponering av Polyacrylamide-belagt Dekk til 2 mm sulfo-SANPAH (trinn 2.2.2.6 ovenfor). Det er avgjørende for å lykkes med dyrking HUVECs på disse underlag som sulfo-SANPAH fjernes fullstendig fra det eksperimentelle systemet følgende ECM konjugasjon. Dette kan best oppnås ved å vaske med DDH 2 O og inkubering glassene i DDH 2 O på en rister over natten. Hvis celler dyrket på polyakrylamid-ECM-er ikke overleve, eller hvis levedyktighet er mindre enn forventet, økt og gjentatt vasking av sulfo-SANPAH etter konjugering til fibronektin (trinn 2.2.2.9) anbefales for potensielt eliminere dette problemet.

Relatert til protokoll 3 (cDNA-transfeksjon og HUVEC kultur på et dekkglass), en stor innflytelse på suksessen av electroporation prosedyren er håndteringen av HUVECs både under trypsinisering av cellene for å fjerne dem fra plast kolbe, og etter avslutningen av electroporation (trinn 3.3 til 3.4, ovenfor). Det er viktig å bry segfullt ut overvåke HUVECs mens i trypsin, og for ikke å overskride den tid som er nødvendig for å få cellene til "round-up" på overflaten av kolben (typisk 1-2 minutter). For mye tid i trypsin er en hovedårsak til død HUVEC, som vanligvis er ikke realisert inntil cellene blir sådd ut på fibronektin-belagte dekkglass (trinn 3.4) og deretter ikke klarer å feste til underlaget.

Av lignende betydning, trenger HUVECs (og de fleste primære celletyper) ikke så bra når suspendert i lange tider i electroporation buffer. Under større skala eksperimenter, for eksempel, der brukeren har fem eller flere forhold som krever electroporation, er det bedre å holde cellene pelleterte i enkelte rør (1 tube per transfeksjon) og å blande dem, en-til-en-gang i electroporation buffer umiddelbart før elektroporering. Denne tilnærmingen reduserer inkubasjonstid i electroporation buffer og maksimert HUVEC overlevelse. I tillegg umiddelbar redning i fullstendig dyrkningsmedier er også crerkritisk følgende electroporation. Rednings forsinkelser av ett minutt eller mer etter elektroporering kan resultere i nær komplett HUVEC død, og bør derfor unngås.

Relaterte cellemigrering assay (protokoll 9), teknikken for dyrking HUVECs ved ekstremt høy tetthet er avhengig av en kritisk modifikasjon (beskrevet i trinn 9.2) av den tradisjonelle HUVEC cellekultur metode (beskrevet i protokoll 3) som krever tørkingen av fibronektin belagte dekkglass for å muliggjøre HUVEC kultur i et meget lite område av dekkglass. Ofte, hvis dekkglasset ikke er helt tørket, eller hvis den forutgående belegning av dekkglass med fibronektin (trinn 2.1 eller 2.2) var ikke effektiv, media inneholdende celler som er plassert på dekkglass vil miste sin overflatespenning og ekspandere til kantene på dekkglass, og dermed redusere tettheten av celler på dekkglass. En metode for å feilsøke dette potensielle problemet er å aspirere media fra dekkglass og deretterplassere dekkglass (fremdeles i sin 35 mm skål) inn på baksiden av biosikkerhet skapet i 5-10 min. Denne tilpasningen kan bidra til at strømmen av luft inne i kabinettet for å hjelpe til med tørking av fatet. Hvis noen synlig væske forblir på dekkglass etter lufttørking, å suge de flytende flekker og igjen la det lufttørke i 5-10 minutter ytterligere i biosikkerhet skapet. Det er viktig å merke seg at det ikke er mulig helt å unngå dette potensielle problem, men den gjør det blir mindre av et problem med gjentatt utøvelse av protokollen. Det er også en feilsøkings anbefaling om at når du forbereder Dekk for celle migrasjon analysen (eller noen analyse, generelt), for å forberede ekstra Dekk og har ekstra HUVECs ready-to-go i tilfelle problemer underveis.

Med disse feilsøkings hensyn i tankene, er det også viktig å understreke nytten av protokollene diskutert og deres implikasjoner i fremtiden cellebiologi forskning. Gyldig til polyacrylamid fremgangsmåte er omfattende, og omfatter ikke bare todimensjonale undersøkelser av celle-ECM inngrep (beskrevet ovenfor), men også tredimensjonale undersøkelser 5. Dette programmet er avgjørende for å øke vår forståelse av hvordan HUVECs regulere cellen form og migrasjon i fysiologiske miljøer og bør gi etterforskere en grunnleggende forståelse av hvordan morfologisk endringer samordnes med cytoskeletal endringer. Mens protokollen beskrevet her er rettet mot målinger av MT vekst dynamikk, de fleste av protokollene kan og bør være tilpasset til å måle en rekke andre mikroskopisk målbare aspekter ved celle-interaksjoner ECM. Med hensyn til MT dynamikk, er det mange kart, inkludert minst 14 familier av kinesins 89, hver med en potensiell rolle i å bidra til HUVEC polaritet og rettet migrasjon, og alle kan bli undersøkt ved hjelp av protokollene som presenteres.

Framtidige undersøkelser bør enLSO være rettet mot celle ECM engasjement i normal versus syke tilstander. HUVEC-protokoller som presenteres her er anvendbare for undersøkelser av normale homeostatiske vaskulære prosesser, så vel som til sykdomstilstander, inkludert hjertesykdom, retinopati, tumorvekst og metastaser, for å nevne noen. Konjugering synlig gjennomsiktige ECM og polyakrylamid substrater av mottagelig samsvar med mikroskopiske undersøkelser vil gi rom for celle-ECM engasjement studier slik at endotelceller vaskulær angiogenese kan overvåkes med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Disse typer eksperimentelle tilnærminger har allerede begynt å avdekke viktige forskjeller i endotelceller form, polaritet, migrasjon, og effekten av proteiner som regulerer disse prosessene 5,31,90. Videre arbeidet bør sikte på å identifisere hvordan kombinasjonen av ECM etterlevelse og dimensjonalitet mechanosensing kan tjene til lokalt kontroll proteiner som er rettet mot og regulerer cytoskeletal dynamikk.

Acknowledgments

Spesiell takk til Dr. Clare M. Waterman for mentorer og diskusjoner, Michelle Baird og Mike Davidson for å gi mange av de fluorescerende cDNA-konstruksjoner som brukes i disse studiene, og Kathryn Applegate og Gaudenz Danuser for å utvikle plusTipTracker MT analyse programvare. Dette arbeidet ble støttet delvis av en bevilgning til KAM fra nasjonale hjerte lunge og blod Institute (NHLBI) og National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aurora A Inhibitor I Selleck Chemicals S1451
2% Bis solution Bio-Rad 1610142
3-aminopropyltrimethyloxysilane Sigma-Aldrich A3648
40% acrylamide Bio-Rad 1610140
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module Agilent Technologies 99462
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-1688-31
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-7788-31
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter Chroma Technology Corp. ET455/50m
ET525/36m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET525/36m
ET605/70m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET605/70m
ET700/75m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET700/75m
Bovine Serum Albumin Fraction V RPI Products A30075-100.0
Clara cooled charge-coupled device camera Andor Technology 77026010
Cy3 donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250
Dyelight 649 goat anti-rat Jackson ImmunoResearch 112-496-068
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) Lonza CC-4143
Fetal bovine serum 25 ml
Bovine brain extract 2.0 ml
Gentamycin sulfate 0.5 ml
Epidermal growth factor 0.5 ml
Hydrocortisone 0.5 ml
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml)  10.0 ml
EGTA Sigma-Aldrich E3884-100G
Electronic shutter Sutter instrument 77016099
Fibronectin EMD Millipore FC010
Glutaraldehyde Thermo Fisher Scientific S80026
HALT Protease inhibitor Thermo Fisher Scientific PI-78425
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HRP goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-036-062
HRP goat anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 111-036-045
Immuno-Blot PVDF Membrane Bio-Rad 162-0174
Lanolin Thermo Fisher Scientific 8006-54-0
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643-500G
Microscope Nikon TiE MEA53100
Motorized stage ASI Technologies MS-2000
Mounting medium Dako CS70330-2
Mouse anti-Aurora A Abcam ab130156
Mouse anti-GAPDH Abcam ab9484
Mouse anti-MCAK Abcam ab50778
Mouse anti-tubulin (DM1A) Cell Signaling Technology 3873S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
NIS Elements software Nikon MQS310000
Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 Contains the electroporation buffer
Paraffin Thermo Fisher Scientific P31-500
Penicillin-Streptomycin (10,000 IU Pen/ml, 10,000 µg Strep/ml) MP Biomedicals 91670249
Petroleum jelly Dow Corning 2021854-1113
Pipes Sigma-Aldrich P6757-100G
plusTipTracker
Rabbit anti-GFP Abcam ab290
Rabbit anti–pT288–Aurora A Abcam ab18318
Rat anti–α-tubulin AbD Serotec MCA78G
Sodium borohydride Thermo Fisher Scientific 678-10
Spinning disk  Andor Technology Yokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAH Thermo Fisher Scientific PI-22589
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific BP151-500
Trypsin Corning MT25053CI
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gerhardt, H., Betsholtz, C. How do endothelial cells orientate? EXS. 94, 3-15 (2005).
  2. Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. J Cell Biol. 161, 1163-1177 (2003).
  3. Bayless, K. J., Johnson, G. A. Role of the cytoskeleton in formation and maintenance of angiogenic sprouts. J Vasc Res. 48, 369-385 (2011).
  4. Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching. Curr Biol. 19, 260-265 (2009).
  5. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. J Cell Biol. 192, 321-334 (2011).
  6. Rodriguez, O. C., et al. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol. 5, 599-609 (2003).
  7. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Actomyosin-based retrograde flow of microtubules in the lamella of migrating epithelial cells influences microtubule dynamic instability and turnover and is associated with microtubule breakage and treadmilling. J Cell Biol. 139, 417-434 (1997).
  8. Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D. Microtubule dynamics: treadmilling comes around again. Curr Biol. 7, R369-R372 (1997).
  9. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Rac1. J Cell Biol. 161, 845-851 (2003).
  10. Ahmad, F. J., Pienkowski, T. P., Baas, P. W. Regional differences in microtubule dynamics in the axon. J Neurosci. 13, 856-866 (1993).
  11. Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).
  12. Dent, E. W., Kalil, K. Axon branching requires interactions between dynamic microtubules and actin filaments. J Neurosci. 21, 9757-9769 (2001).
  13. Dehmelt, L., Nalbant, P., Steffen, W., Halpain, S. A microtubule-based, dynein-dependent force induces local cell protrusions: Implications for neurite initiation. Brain Cell Biol. 35, 39-56 (2006).
  14. van Veen, M. P., van Pelt, J. Dynamic mechanisms of neuronal outgrowth. Prog Brain Res. 102, 95-108 (1994).
  15. Myers, K. A., He, Y., Hasaka, T. P., Baas, P. W. Microtubule transport in the axon: Re-thinking a potential role for the actin cytoskeleton. Neuroscientist. 12, 107-118 (2006).
  16. Stehbens, S., Wittmann, T. Targeting and transport: how microtubules control focal adhesion dynamics. J Cell Biol. 198, 481-489 (2012).
  17. Stehbens, S. J., et al. CLASPs link focal-adhesion-associated microtubule capture to localized exocytosis and adhesion site turnover. Nat Cell Biol. 16, 561-573 (2014).
  18. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Spatial regulation of CLASP affinity for microtubules by Rac1 and GSK3beta in migrating epithelial cells. J Cell Biol. 169, 929-939 (2005).
  19. Kumar, P., et al. GSK3beta phosphorylation modulates CLASP-microtubule association and lamella microtubule attachment. J Cell Biol. 184, 895-908 (2009).
  20. Al-Bassam, J., Chang, F. Regulation of microtubule dynamics by TOG-domain proteins XMAP215/Dis1 and CLASP. Trends Cell Biol. 21, 604-614 (2011).
  21. Desai, A., Verma, S., Mitchison, T. J., Walczak, C. E. Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell. 96, 69-78 (1999).
  22. Hunter, A. W., et al. The kinesin-related protein MCAK is a microtubule depolymerase that forms an ATP-hydrolyzing complex at microtubule ends. Mol Cell. 11, 445-457 (2003).
  23. Lee, T., Langford, K. J., Askham, J. M., Bruning-Richardson, A., Morrison, E. E. MCAK associates with EB1. Oncogene. 27, 2494-2500 (2008).
  24. Walczak, C. E., Mitchison, T. J., Desai, A. XKCM1: a Xenopus kinesin-related protein that regulates microtubule dynamics during mitotic spindle assembly. Cell. 84, 37-47 (1996).
  25. Maney, T., Hunter, A. W., Wagenbach, M., Wordeman, L. Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J Cell Biol. 142, 787-801 (1998).
  26. Lan, W., et al. Aurora B phosphorylates centromeric MCAK and regulates its localization and microtubule depolymerization activity. Curr Biol. 14, 273-286 (2004).
  27. Ganem, N. J., Upton, K., Compton, D. A. Efficient mitosis in human cells lacking poleward microtubule flux. Curr Biol. 15, 1827-1832 (2005).
  28. Wordeman, L., Wagenbach, M., von Dassow, G. MCAK facilitates chromosome movement by promoting kinetochore microtubule turnover. J Cell Biol. 179, 869-879 (2007).
  29. Kline-Smith, S. L., Walczak, C. E. The microtubule-destabilizing kinesin XKCM1 regulates microtubule dynamic instability in cells. Mol Biol Cell. 13, 2718-2731 (2002).
  30. Moore, A. T., et al. MCAK associates with the tips of polymerizing microtubules. J Cell Biol. 169, 391-397 (2005).
  31. Braun, A., et al. Rac1 and Aurora A regulate MCAK to polarize microtubule growth in migrating endothelial cells. J Cell Biol. 206, 97-112 (2014).
  32. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H., Akhmanova, A. Regulation of localization and activity of the microtubule depolymerase MCAK. Bioarchitecture. 1, 80-87 (2011).
  33. Kushner, E. J., et al. Excess centrosomes disrupt endothelial cell migration via centrosome scattering. J Cell Biol. 206, 257-272 (2014).
  34. Siekmann, A. F., Affolter, M., Belting, H. G. The tip cell concept 10 years after: new players tune in for a common theme. Exp Cell Res. 319, 1255-1263 (2013).
  35. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. J Struct Biol. 176, 168-184 (2011).
  36. Montenegro Gouveia, S., et al. In vitro reconstitution of the functional interplay between MCAK and EB3 at microtubule plus ends. Curr Biol. 20, 1717-1722 (2010).
  37. Honnappa, S., et al. An EB1-binding motif acts as a microtubule tip localization signal. Cell. 138, 366-376 (2009).
  38. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker software to measure microtubule dynamics in Xenopus laevis growth cones. J Vis Exp. , e52138 (2014).
  39. Waterman-Storer, C. M. Microtubule/organelle motility assays. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 13, Unit 13 (2001).
  40. Kutys, M. L., Yamada, K. M. An extracellular-matrix-specific GEF-GAP interaction regulates Rho GTPase crosstalk for 3D collagen migration. Nat Cell Biol. 16, 909-917 (2014).
  41. Friedl, P., Wolf, K., Zegers, M. M. Rho-directed forces in collective migration. Nat Cell Biol. 16, 208-210 (2014).
  42. Hellstrom, M., et al. Dll4 signalling through Notch1 regulates formation of tip cells during angiogenesis. Nature. 445, 776-780 (2007).
  43. Semina, E. V., et al. T-cadherin activates Rac1 and Cdc42 and changes endothelial permeability. Biochemistry (Mosc). 74, 362-370 (2009).
  44. Liang, Z. W., et al. Nestin-mediated cytoskeletal remodeling in endothelial cells: novel mechanistic insight into VEGF-induced cell migration in angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 308, C349-C358 (2015).
  45. Kamath, K., Smiyun, G., Wilson, L., Jordan, M. A. Mechanisms of inhibition of endothelial cell migration by taxanes. Cytoskeleton (Hoboken). 71, 46-60 (2014).
  46. Pasquier, E., et al. Antiangiogenic concentrations of paclitaxel induce an increase in microtubule dynamics in endothelial cells but not in cancer cells. Cancer Res. 65, 2433-2440 (2005).
  47. Sun, X., et al. Regulation of tumor angiogenesis by the microtubule-binding protein CLIP-170. Protein Cell. 4, 266-276 (2013).
  48. Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis. Bioarchitecture. 2, 220-227 (2012).
  49. Ganguly, A., Yang, H., Zhang, H., Cabral, F., Patel, K. D. Microtubule dynamics control tail retraction in migrating vascular endothelial cells. Mol Cancer Ther. 12, 2837-2846 (2013).
  50. Wittmann, T., Bokoch, G. M., Waterman-Storer, C. M. Regulation of microtubule destabilizing activity of Op18/stathmin downstream of Rac1. J Biol Chem. 279, 6196-6203 (2004).
  51. Waterman-Storer, C. M., Worthylake, R. A., Liu, B. P., Burridge, K., Salmon, E. D. Microtubule growth activates Rac1 to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts. Nat Cell Biol. 1, 45-50 (1999).
  52. Pasapera, A. M., et al. Rac1-dependent phosphorylation and focal adhesion recruitment of myosin IIA regulates migration and mechanosensing. Curr Biol. 25, 175-186 (2015).
  53. Cooper, J. R., Wagenbach, M., Asbury, C. L., Wordeman, L. Catalysis of the microtubule on-rate is the major parameter regulating the depolymerase activity of MCAK. Nat Struct Mol Biol. 17, 77-82 (2010).
  54. Hu, Y. L., et al. Roles of microtubule dynamics and small GTPase Rac in endothelial cell migration and lamellipodium formation under flow. J Vasc Res. 39, 465-476 (2002).
  55. Davis, G. E., Koh, W., Stratman, A. N. Mechanisms controlling human endothelial lumen formation and tube assembly in three-dimensional extracellular matrices. Birth Defects Res C Embryo Today. 81, 270-285 (2007).
  56. Spaargaren, M., Bos, J. L. Rab5 induces Rac-independent lamellipodia formation and cell migration. Mol Biol Cell. 10, 3239-3250 (1999).
  57. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125, 5917-5926 (2012).
  58. Westenskow, P. D., et al. Ras pathway inhibition prevents neovascularization by repressing endothelial cell sprouting. J Clin Invest. 123, 4900-4908 (2013).
  59. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2008).
  60. Tarnawski, W., et al. A robust algorithm for segmenting and tracking clustered cells in time-lapse fluorescent microscopy. IEEE J Biomed Health Inform. 17, 862-869 (2013).
  61. Rambaldi, D., Pece, S., Di Fiore, P. P. flowFit: a Bioconductor package to estimate proliferation in cell-tracking dye studies. Bioinformatics. 30, 2060-2065 (2014).
  62. Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, e81266 (2013).
  63. Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB(R) package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PLoS One. 8, e72636 (2013).
  64. Klein, J., et al. TLM-Tracker: software for cell segmentation, tracking and lineage analysis in time-lapse microscopy movies. Bioinformatics. 28, 2276-2277 (2012).
  65. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell Tissue Res. 314, 15-23 (2003).
  66. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  67. Davis, G. E., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Koh, W. Molecular basis for endothelial lumen formation and tubulogenesis during vasculogenesis and angiogenic sprouting. Int Rev Cell Mol Biol. 288, 101-165 (2011).
  68. Tung, J. J., Tattersall, I. W., Kitajewski, J. Tips stalks, tubes: notch-mediated cell fate determination and mechanisms of tubulogenesis during angiogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a006601 (2012).
  69. Davis, G. E., et al. Control of vascular tube morphogenesis and maturation in 3D extracellular matrices by endothelial cells and pericytes. Methods Mol Biol. 1066, 17-28 (2013).
  70. Kim, D. J., Martinez-Lemus, L. A., Davis, G. E. EB1, p150Glued, and Clasp1 control endothelial tubulogenesis through microtubule assembly, acetylation, and apical polarization. Blood. 121, 3521-3530 (2013).
  71. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).
  72. Drechsel, D. N., Kirschner, M. W. The minimum GTP cap required to stabilize microtubules. Curr Biol. 4, 1053-1061 (1994).
  73. Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104, 277-288 (1987).
  74. Kirschner, M., Mitchison, T. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 45, 329-342 (1986).
  75. Malikov, V., Cytrynbaum, E. N., Kashina, A., Mogilner, A., Rodionov, V. Centering of a radial microtubule array by translocation along microtubules spontaneously nucleated in the cytoplasm. Nat Cell Biol. 7, 1213-1218 (2005).
  76. Wieczorek, M., Bechstedt, S., Chaaban, S., Brouhard, G. J. Microtubule-associated proteins control the kinetics of microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 17, 907-916 (2015).
  77. Wiese, C., Zheng, Y. Microtubule nucleation: gamma-tubulin and beyond. J Cell Sci. 119, 4143-4153 (2006).
  78. Shin, W. D., Fischer, R. S., Kanchawong, P., Kim, Y., Lim, J., Myers, K. A., Nishimura, Y., Plotnikov, S. V., Thievessen, I., Yarar, D., Sabass, B., Waterman, C. M. Live cell imaging: A laboratory. , 2nd, 119-138 (2010).
  79. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  80. Gundersen, G. G., Bulinski, J. C. Selective stabilization of microtubules oriented toward the direction of cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5946-5950 (1988).
  81. Wittmann, T., Waterman-Storer, C. M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? J Cell Sci. 114, 3795-3803 (2001).
  82. Jakobsson, L., Bentley, K., Gerhardt, H. VEGFRs and Notch: a dynamic collaboration in vascular patterning. Biochem Soc Trans. 37, 1233-1236 (2009).
  83. Blanco, R., Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, a006569 (2013).
  84. Gerhardt, H. VEGF and endothelial guidance in angiogenic sprouting. Organogenesis. 4, 241-246 (2008).
  85. Napione, L., et al. Unraveling the influence of endothelial cell density on VEGF-A signaling. Blood. 119, 5599-5607 (2012).
  86. Benedito, R., et al. Notch-dependent VEGFR3 upregulation allows angiogenesis without VEGF-VEGFR2 signalling. Nature. 484, 110-114 (2012).
  87. Czeisler, C., Mikawa, T. Microtubules coordinate VEGFR2 signaling and sorting. PLoS One. 8, e75833 (2013).
  88. Howes, S. C., Alushin, G. M., Shida, T., Nachury, M. V., Nogales, E. Effects of tubulin acetylation and tubulin acetyltransferase binding on microtubule structure. Mol Biol Cell. 25, 257-266 (2014).
  89. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
  90. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nat Protoc. 7, 2056-2066 (2012).

Tags

Cellular Biology MCAK Aurora Rac1 microtubule endotelceller angiogenese elektroporering fluorescens mikroskopi live-cell imaging
Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K.,… More

Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K., Myers, K. A. High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (114), e54265, doi:10.3791/54265 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter