Assays for nedbrydningen af ​​fejlfoldet proteiner i celler

Summary

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Abstract

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

Introduction

Proteiner er de mest udbredte makromolekyler i celler, og de spiller en vigtig rolle i næsten alle biologiske processer. Den biologiske aktivitet af de fleste proteiner kræver deres foldning i og vedligeholde, de native tredimensionelle strukturer. Proteiner med afvigende konformationer ikke kun mister deres normale funktioner, men også ofte danner opløselige oligomere arter eller aggregater, der forringer funktioner andre proteiner og er giftige for celler ^1,2. For at modvirke protein misfoldning, celler ansætte både molekylære chaperoner, der bistår ufoldede eller delvist foldede polypeptider til at nå deres native konformation, og nedbrydningsprodukter veje, der eliminerer fejlfoldede proteiner ^3. I betragtning af kompleksiteten og stokastiske natur af folde proces, protein misfoldning er uundgåelig, og det kan ikke vendes i tilfælde af mutationer, biosyntetiske fejl og post-translationelle skader ^1. Derfor celler i sidste ende afhængige degradation veje til at opretholde deres protein kvalitet.

Betydningen af ​​cellulært protein kvalitetskontrol (PQC) systemer understreges af forekomsten af ​​protein-misfoldning sygdomme, herunder cancer, diabetes, og mange neurodegenerative lidelser, såsom Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose, Huntingtons sygdom (HD), og spinocerebellar ataksi (SCA) ^4,5. For eksempel mutationer i tumor suppressor p53 er den mest hyppigt genetisk læsion i tumorer, der er forbundet med ~ 50-70% af alle tilfælde ^6. En væsentlig del af p53-mutationer er missense mutationer, der ændrer konformationen af p53, hvilket fører til dannelsen af aggregater ^7. Endvidere er proteiner med udvidede polyQ strækninger genetisk og patologisk forbundet med HD og SCA. Disse progressive og ofte dødelige sygdomme indlysende, når længden af ​​polyQ stræk i de berørte proteiner overstiger en vis threshold, og bliver mere og mere alvorlige som længden af polyQ strækning forlænger ^8.

En attraktiv fremgangsmåde til behandling af disse sygdomme er at terapeutisk styrke cellulære PQC systemer, især nedbrydningsvejene. Imidlertid er de involveret i nedbrydningen af ​​defekte proteiner, især i mammale celler veje, forbliver dårligt forstået. Selv om det er anerkendt, at proteasomet er kritisk vigtigt for nedbrydningen af ​​fejlfoldede proteiner, et vigtigt spørgsmål forbliver udefineret: hvordan misfoldet proteiner specifikt genkendt og målrettet for nedbrydning. Selv PQC systemer er blevet identificeret i cellulære rum herunder cytoplasmaet, det endoplasmatiske reticulum, og mitochondriet, de PQC systemer i kernen er fortsat uklare ^2.

Nylige undersøgelser fra vores laboratorium har identificeret et system, der genkender og nedbryder en række fejlfoldede proteiner i kernenaf pattedyrceller ^9. Dette system består af den promyelocytisk protein (PML), en nuklear protein og et medlem af den tredelte motiv-holdige (TRIM) proteinfamilie, og RNF4, en RING-domæne indeholdende protein. PML, og flere andre TRIM proteiner, besidder SUMO (lille ubiquitin-lignende modifikator) E3-ligaseaktivitet, hvilket letter specificitet og effektivitet af protein SUMOylation ^10. RNF4 tilhører en lille gruppe af SUMO-målrettet ubiquitin ligaser (Stubl), som indeholder en eller flere sumo-interagerende motiver (SIMS) foruden RING domænet, som giver dem den ubiquitin-ligaseaktivitet ^11. Vi fandt, at PML specifikt genkender fejlfoldede proteiner gennem diskrete substrat genkendelsessteder, der kan skelne forskellige funktioner på fejlfoldede proteiner. Ved binding, PML tags fejlfoldede proteiner med poly-kæder af SUMO2 / 3, to næsten identiske pattedyr SUMO proteiner, der kan danne poly-kæder på grund af eksistensen af ​​et internt SUMOylation site. SUMOylated fejlfoldede proteiner derpå genkendes af RNF4, hvilket fører til deres ubiquitinering og proteasomalaktivitet nedbrydning. Vi endvidere vist, at PML-RNF4 system er vigtigt for beskyttelse mod neurodegeneration, som mangel på PML forværrer de adfærdsmæssige og neuropatologiske fejl i en musemodel af SCA type 1 (SCA1) ^9.

For at skelne protein nedbrydning fra andre cellulære mekanismer, der kan regulere protein niveauer, blev satserne for protein omsætning målt ^9. Blandt de hyppigst anvendte metoder til at bestemme protein omsætningen er puls chase og cycloheximid (CHX) chase. Disse to metoder undersøger over tid, henholdsvis den radioaktive isotop-mærkede proteiner af interesse i oversættelse-dygtige celler og totale allerede eksisterende proteiner af interesse i oversættelse-hæmmede celler. , En stor udfordring for at studere patogene og misfoldning-tilbøjelige proteiner er, at halveringstiden af ​​disse proteiner kan være ekstremt long. For eksempel Ataxin-1, Ataxin-7, Huntingtin, α-synuclein, og TDP-43 har alle halveringstider på mere end 12 til 24 timer ^9,12-16. De langsomme omsætningshastigheder af disse proteiner udelukker brugen af ​​CHX chase analyse, fordi de celler, der huser disse proteiner ikke kan overleve forlænget oversættelse inhibering, især fordi de fejlfoldede proteiner selv kan være yderst giftige for celler. Pulsen-chase analyse med isotop mærkning kan også være en udfordring for proteiner, som er yderst sammenlægning-tilbøjelige. De fleste pulse-chase analyser afhængige immunpræcipitering at adskille proteinet af interesse fra alle de andre proteiner, som også radioaktivt mærkede. Denne procedure omfatter normalt langvarige immunpræcipitation og vask procedurer, hvorunder SDS-uopløselige aggregater kan danne, gør analyse med SDS-PAGE-elektroforese unøjagtige.

Her en protokol til at analysere nukleare fejlfoldede proteiner med en langsom omsætningshastighed beskrives ⁹. En patogen form af Ataxin-1 (Atxn1), som indeholder en strækning på 82 glutaminer (Atxn1 82Q) anvendes til dette formål ^8. Når det udtrykkes i celler, en forbedret grønt fluorescerende protein (GFP) fusion af Atxn1 82Q former mikroskopisk synlige indeslutninger i kernen (figur 1A). Pulse chase analyse afslører, at halveringstiden af Ataxn1 82Q er over 18 timer ^9. Atxn1 82Q er sammensat af arter med fejlfoldede konformationer med forskellige karakteristika, samt arter med nativ konformation. Det er sandsynligt, at disse arter nedbrydes med forskellige hastigheder, og derfor bør analyseres separat. Lysater fra Atxn1 82Q-GFP-udtrykkende celler fraktioneret i NP-40-opløselige (opløseligt eller NS, sandsynligvis repræsenterer native proteiner eller forkert foldede monomere / oligomert proteiner) og NP-40-uopløselig (NI, aggregeret / forkert foldede) portioner. Sidstnævnte kan yderligere opdeles i SDS-opløselige (SS; sandsynlige uordnede aggregater) eller SDS-resistent (SR; sandsynlige amyloidfibriller) Fraktioner (figur 1b). NS og SS-fraktioner kan analyseres ved SDS-PAGE efterfulgt af western blotting, hvorimod kan detekteres fraktionen SR ved filter retarderingsassays efterfulgt af immunblotting. CHX chase kombineres med detergentfraktionering metode, og opdagede, at halveringstiden for SS Atxn1 82Q er meget kortere end for NS Atxn1 82Q og total Atxn1 82Q (figur 2A), hvilket indikerer, at SS fraktion kan genkendes og nedbrydes i celler ^9. Denne fremgangsmåde tilvejebringer således et effektivt værktøj til at studere dynamikken i fejlfoldede proteiner og sammenligne deres nedbrydning mønster.

Vi beskriver også en metode, der er egnet til high throughput screening for at identificere makromolekyler eller små forbindelser, der kan modulere nedbrydningen af ​​fejlfoldede proteiner. Denne metode er baseret på en konformt destabiliseret mutant af ildflue luciferase (LucDM) ^17, en model chaperone substrat. Vi har fused LucDM til et nukleart lokaliseringssignal (NLS) til at probe de PQC systemer på dette cellulært rum, og GFP (NLS-LucDM-GFP) til hjælp for påvisning. NLS-LucDM-GFP former mikroskopisk synlige nukleare aggregater i en lille procentdel af celler (figur 3A). Svarende til Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-men ikke dens vildtype modstykke NLS-LucWT-GFP-modificeres ved SUMO2 / 3 og reguleret af PML-RNF4 vej ^9. NLS-LucDM-GFP danner også SS og SR arter, selv om de relative mængder af SS og SR arter er minimal i forhold til NS, anvendelse af betingelserne beskrevet i protokol 3 nedenfor. For at forenkle analysen, vi kun analysere SDS opløselige LucDM (herunder både NS og SS fraktioner) ved SDS-PAGE og western blot. Vigtigere, CHX chase assay viste, at halveringstiden af SDS-opløselige NLS-LucDM-GFP er meget kortere end den for dens vildtype-modparten (figur 3B), hvilket antyder, at LucDM er et specifikt substrat for det system, der genkender og nedbrydesfejlfoldede proteiner.

Nedbrydningen af ​​LucDM-GFP forårsager et betydeligt fald i den samlede fluorescenssignal. Derfor har vi også udviklet en protokol for real-time detektion af cellulær LucDM-GFP hjælp mikroplade fluorescens-baserede assay. Mange high-throughput skærm (HTS) systemer er udviklet til medicin eller gener modificerende cellulære aggregater og cellulære levedygtighed forårsaget af afvigende proteiner ^18-20. Imidlertid er meget få HTSs specielt designet til målretning nedbrydning i pattedyrceller. Denne protokol fungerer som et robust system til hurtig og omfattende analyse af virkningerne af proteinekspression, knockdown, og lægemiddelbehandling på cellulær fejlfoldet proteinnedbrydning. Brug HeLa celler som eksempel nedenfor beskrives de protokoller til analyse af disse to fejlfoldede proteiner. Analyserne kan også anvendes på andre cellelinier, selvom transfektionsbetingelser og tidsforløb kan være nødvendigt at være optimeret til individuelle cellelinier.

Protocol

1. Fremstilling af reagens Forbered cellelyse-buffer (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP-40). Supplement 2 mM DTT, 1x komplet protease cocktail, og 250 IU / ml Benzonase før brug. Forbered pellet puffer (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl2). Supplement 2 mM DTT, 1x komplet protease cocktail og 250 IU / ml Benzonase før brug. Forbered 3x kogende puffer (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplement 150 mM DTT før brug. Forbered lav fluorescens DMEM…

Representative Results

I en steady state analyse, kan mikroskopisk synlige Atxn1 82Q-GFP nukleare aggregater iagttages hos 30 – 50% af HeLa-celler 20 timer efter transfektion (figur 1A). Western blot analyse af NS og SS-fraktioner under anvendelse af anti-GFP-antistof viser en distinkt bånd af Atxn1 82Q-GFP mellem 100 kDa og 150 kDa markører, svarende til proteinets molekylvægt (figur 1B). Atxn1 82Q-GFP i SR fraktionen kan detekteres enten ved filter retardering assay eller…

Discussion

Mekanismer, der regulerer nedbrydningen af ​​fejlfoldede proteiner er afgørende for at opretholde homøostase af cellulære proteiner, og de sandsynligvis repræsenterer værdifulde lægemiddelmål for behandling af neurodegenerative lidelser og andre protein-misfoldning sygdomme. Her bliver assays der undersøger nedbrydningen af ​​fejlfoldede proteiner beskrevet, under anvendelse af en patogen Atxn1 protein (Atxn1 82Q) og en nuklear lokaliseret luciferase mutant (NLS-LucDM) som eksempler.

<p class="jove_c…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11995-092
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10082147
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
MG132	Sigma-Aldrich	M8699
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	45000232
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Boehringer Mannheim	4693159001
Bio-Dot Apparatus	Bio-Rad	1706545
Living Colors GFP Monoclonal Antibody	Clonetech	632375
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG	Sigma-Aldrich	A45060-200UL
Amino acids	Sigma-Aldrich		Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium
Olympus IX-81  Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom	Sigma-Greiner	89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Infinite 200® PRO
Cellulose acetate membrane 0.2 µm	Sterlitech	CA023001
Prism 5	GraphPad		Statistical analysis software