Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

Summary

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Abstract

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

Introduction

Eiwitten zijn de meest voorkomende macromoleculen in cellen, en zij een essentiële rol in vrijwel alle biologische processen. De biologische activiteit van de meeste eiwitten vereist de vouwen naar en handhaving, de natieve driedimensionale structuren. Eiwitten met afwijkende conformaties niet alleen verliezen hun normale functies, maar ook vaak vormen oplosbare oligomere species of aggregaten die de functies van andere eiwitten verstoren en toxisch zijn voor cellen ^1,2. Om eiwitten verkeerd vouwen tegen te gaan, cellen werken zowel moleculaire chaperones, die ongevouwen of gedeeltelijk gevouwen polypeptiden helpen hun natieve conformatie te bereiken, en degradatie paden, die verkeerd gevouwen eiwitten ³ te elimineren. Gezien de complexiteit en stochastische aard van het vouwproces, eiwit misfolding onvermijdelijk, en kan niet worden omgekeerd bij mutaties biosynthetische fouten, en post-translationele schade ^1. Daarom cellen uiteindelijk afhankelijk degradation wegen naar hun eiwit kwaliteit te handhaven.

Het belang van cellulaire proteïne kwaliteitscontrole (PQC) systemen wordt onderstreept door het voorkomen van eiwit misfolding ziekten, waaronder kanker, diabetes en vele neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson, amyotrofe laterale sclerose, ziekte van Huntington (HD), en spinocerebellaire ataxie (SCA) ^4,5. Bijvoorbeeld mutaties in het p53 tumor suppressor is de meest frequent genetische laesie in tumoren geassocieerd met ~ 50-70% van de gevallen ^6. Een aanzienlijke fractie van p53 mutaties missense mutaties die de conformatie van p53 te veranderen, wat leidt tot de vorming van aggregaten ^7. Bovendien zijn eiwitten met uitgebreid polyQ stukken genetisch en pathologisch geassocieerd met HD en SCA. Deze progressieve en vaak dodelijke ziekten manifesteren wanneer de lengte van de polyQ rek in de betreffende eiwitten boven een bepaalde thresvasthouden en steeds ernstiger als de lengte van de polyQ rek verlengt ^8.

Een aantrekkelijke benadering voor het behandelen van deze ziekten therapeutisch versterken PQC cellulaire systemen, met name de afbraakroutes. De betrokken bij de afbraak van defecte eiwitten, met name in zoogdiercellen pathways, blijven slecht begrepen. Hoewel wordt erkend dat het proteasoom een ​​cruciale rol in de afbraak van verkeerd gevouwen eiwitten, van vitaal belang blijft undefined hoe verkeerd gevouwen eiwitten specifiek herkend en gericht voor afbraak. Ofschoon PQC systemen geïdentificeerd in cellulaire compartimenten inclusief het cytoplasma, het endoplasmatisch reticulum, en de mitochondrion, de PQC systemen in de kern ² onduidelijk.

Recente studies door onze lab een systeem dat in de kern herkent en degradeert verschillende verkeerd gevouwen eiwitten geïdentificeerdvan zoogdiercellen ^9. Dit systeem bestaat uit de promyelocytische eiwit (PML), een nucleair eiwit en een lid van de tripartiete motief-bevattende (TRIM) eiwitfamilie en RNF4 een RING-domein bevattend eiwit. PML, en verscheidene andere TRIM eiwitten bezitten SUMO (kleine ubiquitine-achtige modifier) ​​E3 ligase activiteit, die de specificiteit en efficiëntie van eiwit sumoylation ¹⁰ vergemakkelijkt. RNF4 behoort tot een kleine groep van SUMO gerichte ubiquitine ligasen (Stubl), die één of meer sumo interactie motieven (SIM) naast het RING domein dat biedt hen de ubiquitine ligase activiteit ¹¹ bevatten. We vonden dat PML specifiek herkent verkeerd gevouwen eiwitten door middel van discrete substraat erkenning sites die verschillende functies kunnen onderscheiden op verkeerd gevouwen eiwitten. Na binding, PML markeringen verkeerd gevouwen eiwitten met poly-ketens van SUMO2 / 3, twee vrijwel identieke zoogdieren SUMO-eiwitten die poly-ketens door de aanwezigheid van een interne sumoylation site vormen. SUMOylated verkeerd gevouwen eiwitten worden vervolgens herkend door RNF4, wat leidt tot hun ubiquitinatie en proteasomale degradatie. Verder hebben we aangetoond dat de PML-RNF4 systeem is belangrijk voor de bescherming tegen neurodegeneratie, zoals deficiëntie in PML verergert gedrags- en neuropathologische afwijkingen van een muismodel van SCA type 1 (SCA1) ^9.

Om afbraak van eiwitten te onderscheiden van andere cellulaire mechanismen die proteïne niveaus kunnen reguleren, de tarieven van de omzet eiwit werd gemeten ^9. Een van de meest gebruikte methoden om de omzet eiwit te bepalen zijn pulse chase en cycloheximide (CHX) chase. Deze twee methoden worden onderzocht in de tijd, respectievelijk het radioisotoop gemerkte eiwitten van belang in translatie-bekwame cellen en totaal reeds bestaande eiwitten van belang in translatie geremd cellen. Echter een grote uitdaging voor de studie van pathogene en misvouwing gevoelige eiwitten is dat de halfwaardetijd van deze eiwitten zeer lo kanng. Bijvoorbeeld, ataxine-1, ataxine-7, huntingtine, α-synucleïne en TDP-43 hebben halfwaardetijden van meer dan 12 tot 24 uur ^9,12-16. De trage omzet tarieven van deze eiwitten beletsel voor het gebruik van de CHX chase analyse, omdat de cellen die deze eiwitten langdurige vertaling remming niet kan overleven, vooral omdat het verkeerd gevouwen eiwitten zelf kunnen zeer giftig voor de cellen. De puls-chase analyse met isotopische labeling kan ook een uitdaging voor eiwitten die zeer aggregatie-gevoelig bent. Meest pulse-chase assays afhankelijk immunoprecipitatie het eiwit van belang te scheiden van alle andere eiwitten die ook radioactief gelabeld. Deze procedure omvat doorgaans lang immunoprecipitatie en wassen procedures, waarbij SDS-onoplosbare aggregaten kunnen vormen, waardoor de analyse met SDS-PAGE elektroforese onnauwkeurig.

Hier een protocol om de nucleaire verkeerd gevouwen eiwitten te analyseren met een lage omloopsnelheid is beschreven ⁹. Een pathogene vorm van ataxine-1 (Atxn1) dat een gedeelte van 82 glutaminen (Atxn1 82Q) bevat wordt gebruikt voor dit doel ^8. Uitgedrukt in cellen, een versterkt groen fluorescent eiwit (GFP) fusie van Atxn1 82Q vormen microscopisch zichtbare insluitsels in de nucleus (figuur 1A). Pulse chase analyse blijkt dat de halfwaardetijd van Ataxn1 82Q is meer dan 18 uur ^9. Atxn1 82Q bestaat uit soorten met verkeerd gevouwen conformaties van verschillende kenmerken, alsook soorten met natieve conformatie. Het is waarschijnlijk dat deze soorten worden afgebroken met verschillende snelheden, en moeten derhalve apart worden geanalyseerd. Lysaten van Atxn1 82Q-GFP tot expressie cellen worden gefractioneerd in NP-40-oplosbare (oplosbaar of NS, waarschijnlijk vertegenwoordigen natieve eiwitten of verkeerd gevouwen monomeer / oligomere eiwitten) en NP-40-onoplosbaar (NI, geaggregeerd / misfolded) porties. De laatste kan verder worden onderverdeeld in SDS-oplosbare (SS; waarschijnlijk wanordelijke aggregaten) of SDS-resistente (SR, waarschijnlijk amyloïde fibrillen) Fracties (Figuur 1B). NS en SS fracties kunnen worden geanalyseerd door SDS-PAGE gevolgd door Western blotting, terwijl de fractie van SR filter retardatie assays gevolgd door immunoblotting kan worden gedetecteerd. CHX chase wordt gecombineerd met het detergens fractioneringsmethode, en ontdekten dat de halfwaardetijd van SS Atxn1 82Q is veel korter dan die van NS Atxn1 82Q en totale Atxn1 82Q (Figuur 2A), wat aangeeft dat de SS fractie gemakkelijk kan worden herkend en afgebroken ⁹ in cellen. Zo, deze methode biedt een krachtig instrument om de dynamiek van verkeerd gevouwen eiwitten te bestuderen en om hun degradatie patroon te vergelijken.

We beschrijven ook een werkwijze die geschikt is voor high throughput screening voor het identificeren van macromoleculen of kleine verbindingen die de afbraak van verkeerd gevouwen eiwitten kan moduleren. Deze methode is gebaseerd op een conformationeel gedestabiliseerd mutant van vuurvlieg luciferase (LucDM) ^17, een model chaperonne substraat. We hebben zekeringd LucDM een nucleair lokalisatiesignaal (NLS) naar de PQC systemen in dit cellulaire compartiment probe en GFP (NLS-GFP-LucDM) voor het gemak van detectie. NLS-GFP-LucDM vormen microscopisch zichtbare nucleaire aggregaten in een klein percentage cellen (Figuur 3A). Net als bij Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-maar niet de wild-type tegenhanger NLS-LucWT-GFP-wordt gewijzigd door SUMO2 / 3 en gereguleerd door de PML-RNF4 route ^9. NLS-GFP-LucDM vormt tevens SS en SR species, hoewel de relatieve hoeveelheden van SS en SR soorten minimaal vergeleken NS met de onder protocol 3 beschreven omstandigheden. Om de analyse te vereenvoudigen we analyseren alleen SDS oplosbare LucDM (zowel NS en SS fracties) door SDS-PAGE en Western blot. Belangrijker CHX chase analyse toonde aan dat de halfwaardetijd van SDS-oplosbare NLS-LucDM-GFP is veel korter dan die van de wildtype tegenhanger (figuur 3B), wat suggereert dat LucDM is een specifiek substraat voor het systeem herkent en degradeertverkeerd gevouwen eiwitten.

De afbraak van LucDM-GFP veroorzaakt een significante vermindering van het totale fluorescentiesignaal. Daarom hebben we ook een protocol ontwikkeld voor real-time detectie van cellulaire LucDM-GFP behulp microplaat fluorescentie-gebaseerde test. Veel high-throughput screen (HTS) systemen zijn ontwikkeld voor drugs of genen modificeren van cellulaire aggregaten en cellulaire levensvatbaarheid veroorzaakt door afwijkende eiwitten ^18-20. Echter, weinig HTSs speciaal voor het richten afbraak in zoogdiercellen. Dit protocol dient als een robuust systeem voor snelle en grootschalige analyse van de effecten van eiwitexpressie knockdown en behandeling met geneesmiddelen op mobiele misfolded eiwitafbraak. HeLa-cellen gebruikt zoals bijvoorbeeld hieronder beschrijven we de protocollen voor de analyse van deze twee verkeerd gevouwen eiwitten. De assays kunnen ook worden toegepast op andere cellijnen, hoewel transfectie omstandigheden en tijdsduur moet worden geoptimaliseerd voor individuele cellijnen.

Protocol

1. Bereiding van reagens Bereid cellysis buffer (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP-40). Supplement 2 mM DTT, 1x volledige protease cocktail en 250 IU / ml benzonase vóór gebruik. Bereid pellet buffer (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl2). Supplement 2 mM DTT, 1x volledige protease cocktail en 250 IU / ml benzonase voor gebruik. Bereid 3x kokende buffer (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplement 150 mM DTT vóór gebruik. Bereid low-fluorescent…

Representative Results

In een steady state analyse kan microscopisch zichtbare Atxn1 82Q-GFP nucleaire aggregaten waargenomen in 30-50% van HeLa-cellen 20 uur na transfectie (Figuur 1A). Western blot analyse van NS en SS fracties met behulp van anti-GFP-antilichaam toont een duidelijke band van Atxn1 82Q-GFP tussen 100 kDa en 150 kDa markers, die overeenkomt met het molecuulgewicht van het eiwit (Figuur 1B). Atxn1 82Q-GFP in de SR fractie kan worden gedetecteerd hetzij filter …

Discussion

Mechanismen die de afbraak van verkeerd gevouwen eiwitten reguleren zijn essentieel voor het behoud van de homeostase van cellulaire eiwitten, en ze waarschijnlijk een waardevolle drug targets voor de behandeling van neurodegeneratieve aandoeningen en andere eiwit-misfolding ziekten. Hier, assays die de afbraak van verkeerd gevouwen proteïnen onderzocht worden beschreven, onder toepassing van een pathogeen Atxn1 eiwit (Atxn1 82Q) en een nucleair gelokaliseerde mutant luciferase (NLS-LucDM) als voorbeeld.

<p class="…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11995-092
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10082147
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
MG132	Sigma-Aldrich	M8699
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	45000232
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Boehringer Mannheim	4693159001
Bio-Dot Apparatus	Bio-Rad	1706545
Living Colors GFP Monoclonal Antibody	Clonetech	632375
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG	Sigma-Aldrich	A45060-200UL
Amino acids	Sigma-Aldrich		Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium
Olympus IX-81  Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom	Sigma-Greiner	89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Infinite 200® PRO
Cellulose acetate membrane 0.2 µm	Sterlitech	CA023001
Prism 5	GraphPad		Statistical analysis software