Assays for nedbrytning av misfoldede Proteiner i Cells

Summary

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Abstract

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

Introduction

Proteiner er de mest tallrike makromolekyler i cellene, og de spiller en viktig rolle i nesten alle biologiske prosesser. Den biologiske aktiviteten til de fleste proteiner krever deres bretting inn i, og opprettholder, de native tredimensjonale strukturer. Proteiner med avvikende conformations ikke bare miste sine normale funksjoner, men også ofte danner løselige oligomeric arter eller aggregater som svekker funksjonene til andre proteiner og er giftige for cellene ^1,2. For å motvirke protein misfolding, celler benytter både molekylære anstand, som bistår brettede eller delvis foldet polypeptider å nå sitt opprinnelige eksteriør, og nedbrytningsmekanismer, som eliminerer misfoldede proteiner ^3. På grunn av kompleksiteten og stokastiske natur av bretteprosessen, er protein misfolding uunngåelig, og det kan ikke reverseres i tilfelle av mutasjoner, biosyntetiske feil, og post-translasjonelle skader ^1. Derfor celler slutt stole på degradation veier for å opprettholde sin proteinkvalitet.

Betydningen av celleprotein kvalitetskontroll (PQC) systemer er understreket av utbredelsen av protein-misfolding sykdommer, inkludert kreft, diabetes, og mange neurodegenerative lidelser så som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, Huntingtons sykdom (HD), og spinocerebellar ataksi (SCA) ^4,5. For eksempel, mutasjoner i p53 tumor suppressor er den mest hyppig genetisk lesjon i tumorer, assosiert med ~ 50-70% av alle tilfellene ^6. En betydelig fraksjon av p53-mutasjoner er missense mutasjoner som endrer konformasjonen av p53, som fører til dannelse av aggregater ^7. Videre er proteiner med utvidede polyQ strekninger genetisk og patologisk forbundet med HD og SCA. Disse progressive og ofte fatale sykdommer åpenbar når lengden av polyQ strekk i de aktuelle proteinene overstiger en viss threshold, og blir stadig mer alvorlig som lengden av polyQ strekningen forlenger ^8.

En attraktiv metode for behandling av disse sykdommene er til terapeutisk styrke cellulære PQC systemer, spesielt de degraderingsreaksjonsveier. Imidlertid, er involvert i nedbrytning av defekte proteiner, særlig de i pattedyrceller veier forblir dårlig forstått. Selv om det har vært kjent at proteosomet er kritisk viktig for nedbrytning av misfoldede proteiner, forblir en viktig sak udefinert: hvor misfolded proteiner er spesielt anerkjent og målrettet for degradering. Dessuten, selv om PQC systemer har blitt identifisert i cellulære inkludert i cytoplasma, det endoplasmatiske retikulum, og mitokondrie, PQC systemene i kjernen forblir uklare ^2.

Nyere studier av vår lab har identifisert et system som gjenkjenner og forringer en rekke misfoldede proteiner i kjernenav pattedyrceller ^9. Dette systemet består av promyelocytic protein (PML), en kjernefysisk protein og et medlem av den tredelte motiv holdige (TRIM) protein familie, og RNF4, en RING-domene som inneholder protein. PML, og flere andre TRIM proteiner, innehar SUMOs (liten ubiquitin-lignende modifiserende middel) E3-ligase aktivitet, noe som letter spesifisiteten og effektiviteten av protein SUMOylation ^10. RNF4 tilhører en liten gruppe av SUMO-målrettet ubiquitin ligaser (Stubl), som inneholder en eller flere sumo-samspill motiver (SIMS) i tillegg til RING domenet som gir dem den ubiquitin ligase aktivitet ^11. Vi fant ut at PML spesifikt gjenkjenner misfoldede proteiner gjennom diskrete substrat gjenkjenningsseter som kan skjelne forskjellige funksjoner på misfoldede proteiner. Ved binding, PML-koder misfoldede proteiner med poly-kjeder av SUMO2 / 3, to nesten identiske pattedyr SUMO proteiner som kan danne poly-kjedene på grunn av eksistensen av en intern SUMOylation nettstedet. SUMOylated misfoldede proteiner blir så gjenkjent av RNF4, noe som fører til deres ubiquitinering og proteasomal degradering. Vi videre vist at PML-RNF4 system er viktig for beskyttelse mot nevrodegenerasjon, som mangel på PML forverrer de atferdsmessige og nevropatologiske defekter i en musemodell for SCA type 1 (SCA1) ^9.

For å skille protein degradering fra andre cellulære mekanismene som kan regulere proteinnivåer, ble satsene for protein omsetningen målt ^ni. Blant de mest brukte metoder for å bestemme protein omsetningen er puls jage og cycloheximide (CHX) jage. Disse to metoder undersøke over tid, henholdsvis de radioisotop-merkede proteiner av interesse i omregnings-dyktig celler og totalt antall forhåndseksisterende proteiner av interesse i omregnings-inhiberte celler. Imidlertid er en stor utfordring for å studere patogene og misfolding utsatt proteiner er at halveringstiden for disse proteinene kan være ekstremt long. For eksempel, Ataxin-en, Ataxin-7, huntingtin, α-synuclein, og TDP-43 har alle halveringstider på mer enn 12 til 24 timer ^9,12-16. Den langsomme omsetning priser for disse proteinene utelukker bruk av den CHX chase analyse fordi celler som disse proteiner ikke kan overleve lengre tids oversettelse inhibering, spesielt fordi de misfoldede proteinene i seg selv kan være meget giftige for cellene. Pulsen-chase analyse med isotop merking kan også være utfordrende for proteiner som er svært aggregering utsatt. De fleste puls-chase assays er avhengige av immunopresipitering for å separere proteinet av interesse fra alle andre proteiner som også radioaktivt merkede. Denne prosedyren omfatter normalt lange immunoutfellingsstudier og vaskeprosedyrer, hvor SDS-uoppløselige aggregater kan dannes, noe som gjør analyse med SDS-PAGE elektroforese unøyaktig.

Her en protokoll for å analysere kjerne misfoldede proteiner med lav omløpshastighet er beskrevet ⁹. En patogene form av Ataxin-1 (Atxn1) som inneholder en strekning av 82 glutamines (Atxn1 82Q) er brukt til dette formålet ^8. Når uttrykt i celler, en forbedret grønt fluorescerende protein (GFP) sammensmelting av Atxn1 82Q former mikroskopisk synlige inneslutninger i kjernen (figur 1A). Pulse jage analyse viser at halveringstiden for Ataxn1 82Q er over 18 timer ^9. Atxn1 82Q er sammensatt av arter med misfoldede conformations av forskjellige egenskaper, samt arter med naturlig konformasjon. Det er sannsynlig at disse artene er degradert til ulike priser, og dermed bør analyseres separat. Lysates fra Atxn1 82Q-GFP-uttrykke celler blir fraksjonert i NP-40-oppløselig (løselig eller NS, sannsynligvis representerer innfødte proteiner eller misfoldede monomere / oligomere proteiner) og NP-40-uløselig (NI, aggregert / misfoldede) deler. Sistnevnte kan videre deles inn i SDS-oppløselig (SS; sannsynlig uordnede aggregater) eller SDS-resistente (SR, sannsynlige amyloidfibriler) Fraksjoner (figur 1B). NS og SS fraksjoner kan analyseres ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av western-blotting, mens SR fraksjonen kan detekteres ved filter retardasjon analyser, etterfulgt av immunblotting. CHX chase er kombinert med vaskemiddel fraksjoneringsmetode, og oppdaget at halveringstiden til SS Atxn1 82Q er mye kortere enn for NS Atxn1 82Q og total Atxn1 82Q (figur 2A), som indikerer at SS fraksjonen lett kan gjenkjennes og nedbrytes i cellene ^9. Således tilveiebringer denne fremgangsmåte et kraftig verktøy for å studere dynamikken i misfoldede proteiner og for å sammenligne deres degradering mønster.

Vi beskriver også en fremgangsmåte som er passende for høy kapasitets screening for å identifisere makromolekyler eller små forbindelser som kan modulere nedbrytningen av misfoldede proteiner. Denne metoden er basert på et konformasjonelt destabilisert mutant av ildflueluciferase (LucDM) ^17, en modell anstand substrat. Vi har sikringd LucDM til et kjernefysiske lokalisering signal (NLS) til sondere PQC systemer i denne cellerommet, og GFP (NLS-LucDM-GFP) for bekvemmeligheten av gjenkjenning. NLS-LucDM-GFP former mikroskopisk synlige atomstørrelser i en liten prosentandel av celler (figur 3A). I likhet med Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-men ikke sin villtype motstykke NLS-LucWT-GFP-modifisert ved SUMO2 / 3 og regulert av PML-RNF4 vei ^9. NLS-LucDM-GFP danner også SS og SR art, selv om de relative mengder av SS og SR arter er minimal i forhold til NS, ved bruk av betingelsene beskrevet i protokollen 3 nedenfor. For å forenkle analysen, vi bare analysere SDS løselig LucDM (inkludert både NS og SS fraksjoner) ved SDS-PAGE og western blot. Viktigere, CHX jage analyse viste at halveringstiden for SDS-oppløselig NLS-LucDM-GFP er mye kortere enn for dens villtype-motstykke (figur 3B), hvilket antyder at LucDM er et spesifikt substrat for det system som gjenkjenner og forringermisfoldede proteiner.

Nedbrytningen av LucDM-GFP fører til en betydelig nedgang i total fluorescens signal. Derfor har vi også utviklet en protokoll for sporing i sanntid av mobilnettet LucDM-GFP bruker mikro fluorescens-basert analysen. Mange high-throughput skjermen (HTS) systemer er utviklet for narkotika eller gener endrer cellulære aggregater og cellulære levedyktighet forårsaket av avvikende proteiner ^18-20. Imidlertid er meget få HTSs spesielt utviklet for målretting mot nedbrytning i pattedyrceller. Denne protokollen tjener som et robust system for hurtig og stor-skala-analyse av virkningene av proteinekspresjon, knockdown, og medikamentbehandling på cellulær misfolded proteinnedbrytingen. Ved hjelp av HeLa-celler som eksempel, under vi beskriver protokollene for analyse av disse to misfoldede proteiner. Analysene kan også anvendes på andre cellelinjer, selv om transfeksjon forhold og tidsforløpet kan trenge å bli optimalisert for individuelle cellelinjer.

Protocol

1. Fremstilling av Reagens Fremstille cellelyseringsbuffer (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP-40). Supplement 2 mM DTT, 1x komplett protease cocktail, og 250 IU / ml benzonase før bruk. Fremstille pellet-buffer (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl2). Supplement 2 mM DTT, 1x komplett protease cocktail og 250 IE / ml benzonase før bruk. Forbered 3x koke buffer (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplement 150 mM DTT før bruk. Forbered lav-fluoresce…

Representative Results

I en stabil tilstand analyse, kan mikroskopisk synlige Atxn1 82Q-GFP nukleære aggregater holdes i 30 – 50% av HeLa-celler 20 timer etter transfeksjon (figur 1A). Western blot-analyse av NS og SS-fraksjoner under anvendelse av anti-GFP-antistoff viser et tydelig bånd av Atxn1 82Q-GFP mellom 100 kDa og 150 kDa markører, svarende til proteinets molekylvekt (figur 1B). Atxn1 82Q-GFP i SR fraksjonen kan påvises enten ved filter retardasjon analyse, eller …

Discussion

Mekanismer som regulerer nedbrytningen av misfoldede proteiner er viktig for å opprettholde homeostase av cellulære proteiner, og de sannsynligvis representerer verdifulle drug targets for behandling av neurodegenerative lidelser og andre protein-misfolding sykdommer. Her er analyser som undersøker nedbrytningen av misfoldede proteiner beskrevet, ved hjelp av en sykdomsfremkallende Atxn1 protein (Atxn1 82Q) og en kjernefysisk lokalisert luciferase mutant (NLS-LucDM) som eksempler.

For å …

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11995-092
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10082147
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
MG132	Sigma-Aldrich	M8699
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	45000232
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Boehringer Mannheim	4693159001
Bio-Dot Apparatus	Bio-Rad	1706545
Living Colors GFP Monoclonal Antibody	Clonetech	632375
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG	Sigma-Aldrich	A45060-200UL
Amino acids	Sigma-Aldrich		Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium
Olympus IX-81  Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom	Sigma-Greiner	89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Infinite 200® PRO
Cellulose acetate membrane 0.2 µm	Sterlitech	CA023001
Prism 5	GraphPad		Statistical analysis software