Los ensayos para la degradación de proteínas en células de mal plegadas

Summary

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Abstract

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

Introduction

Las proteínas son las macromoléculas más abundantes en las células, y juegan un papel esencial en casi todos los procesos biológicos. La actividad biológica de la mayoría de las proteínas requiere de su plegado en, y mantener, las estructuras nativas tridimensionales. Las proteínas con conformaciones aberrantes no sólo pierden sus funciones normales, sino que también forman con frecuencia especies oligoméricas solubles o agregados que deterioran las funciones de otras proteínas y que son tóxicos para las células ^1,2. Para contrarrestar el mal plegamiento de proteínas, las células emplean ambas chaperonas moleculares, que ayudan polipéptidos no plegados o parcialmente plegadas para alcanzar su conformación nativa, y las vías de degradación, que eliminan las proteínas mal plegadas ^3. Dada la complejidad y la naturaleza estocástica del proceso de plegado, el mal plegamiento de proteínas es inevitable, y no se puede invertir en el caso de las mutaciones, errores biosintéticas, y los daños posteriores a la traducción ^1. Por lo tanto, en última instancia, las células se basan en degradacvías de iones para mantener su calidad de la proteína.

La importancia del control de calidad de la proteína celular (PQC) sistemas es subrayada por la prevalencia de enfermedades en proteínas misfolding, incluyendo cáncer, diabetes, y muchos trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington (HD), y degeneración espinocerebelosa (SCA) ^4,5. Por ejemplo, las mutaciones en el p53 supresor de tumores es la lesión más frecuentemente genética única en tumores, asociado a ~ 50-70% de todos los casos ^6. Una fracción sustancial de las mutaciones de p53 son mutaciones de sentido erróneo que alteran la conformación de p53, lo que lleva a la formación de agregados ^7. Por otra parte, las proteínas con tramos polyQ expandido están asociados genéticamente y patológicamente con HD y SCA. Estas enfermedades progresivas y, a menudo fatales manifiesto cuando la longitud del tramo polyQ en las proteínas afectadas supera determinados thresmantenga, y se vuelve cada vez más graves como la longitud del tramo polyQ prolonga ^8.

Un enfoque atractivo para el tratamiento de estas enfermedades es para reforzar terapéuticamente sistemas celulares PQC, especialmente las vías de degradación. Sin embargo, las vías de señalización implicadas en la degradación de proteínas defectuosas, en particular los de las células de mamíferos, siguen siendo poco conocidos. Aunque se ha reconocido que el proteasoma es críticamente importante para la degradación de las proteínas mal plegadas, una cuestión vital permanece indefinido: cómo las proteínas mal plegadas son reconocidos específicamente y destinada a la degradación. Por otra parte, aunque los sistemas PQC se han identificado en los compartimentos celulares, incluyendo el citoplasma, retículo endoplásmico, y la mitocondria, los sistemas PQC en el núcleo siguen sin estar claros ^2.

Estudios recientes realizados por nuestro laboratorio han identificado un sistema que reconoce y se degrada una variedad de proteínas mal plegadas en el núcleode células de mamíferos ^9. Este sistema se compone de la proteína promielocítica (PML), una proteína nuclear y un miembro de la familia de proteínas tripartito motivo que contienen (TRIM), y RNF4, un anillo-dominio que contienen proteínas. PML, y varias otras proteínas TRIM, poseen SUMO (pequeño modificador semejante a la ubiquitina) la actividad de ligasa E3, lo que facilita la especificidad y la eficiencia de Sumoylation proteína ^10. RNF4 pertenece a un pequeño grupo de ubiquitina ligasas de SUMO-dirigida (Stubl), que contienen uno o más motivos de sumo-interactuando (SIMS), además del anillo de dominio que les brinda la actividad de ubiquitina ligasa ^11. Se encontró que la PML reconoce específicamente las proteínas mal plegadas a través de sitios de reconocimiento de sustrato discretos que pueden discernir características distintas de las proteínas mal plegadas. Tras la unión, las etiquetas de PML mal plegadas proteínas con poli-cadenas de SUMO2 / 3, dos proteínas de mamíferos SUMO casi idénticos que pueden formar poli-cadenas debido a la existencia de un sitio de Sumoylation interna. Sproteínas mal plegadas UMOylated son luego reconocidos por RNF4, lo que conduce a su ubiquitinación y degradación proteasomal. Además, demostró que el sistema de PML-RNF4 es importante para la protección contra la neurodegeneración, como la deficiencia en PML exacerba los defectos de comportamiento y neuropatológicas de un modelo de ratón de tipo SCA 1 (SCA1) ^9.

Para distinguir la degradación de proteínas de otros mecanismos celulares que pueden regular los niveles de proteína, las tasas de rotación de proteínas se midió ^9. Entre los métodos más frecuentemente utilizados para determinar el volumen de negocios de proteínas son la persecución de pulso y persecución cicloheximida (CHX). Estos dos métodos examinan con el tiempo, respectivamente, las proteínas marcados con radioisótopos de interés en las células de traducción-competente y proteínas preexistentes totales de interés en las células de traducción inhibido. Sin embargo, un reto importante para el estudio de proteínas patógenas y misfolding propensos es que la vida media de estas proteínas puede ser extremadamente long. Por ejemplo, Ataxina-1, Ataxina-7, huntingtina, α-sinucleína, y TDP-43 todos tienen vidas medias de más de 12 a 24 h ^9,12-16. Las tasas de rotación lenta de estas proteínas no permitan la utilización del análisis CHX persecución porque las células que albergan estas proteínas pueden no sobrevivir inhibición de la traducción prolongado, especialmente debido a que las proteínas mal plegadas a sí mismos pueden ser altamente tóxicos para las células. El análisis de pulso-caza con marcaje isotópico también puede ser un reto para las proteínas que son altamente propensas a la agregación. La mayoría de los ensayos de pulso-caza se basan en la inmunoprecipitación para separar la proteína de interés de todas las otras proteínas que también están etiquetados radioactivamente. Este procedimiento incluye normalmente largos procedimientos de inmunoprecipitación y de lavado, durante los cuales pueden formar agregados insolubles en SDS, haciendo que el análisis con electroforesis en SDS-PAGE incorrecto.

Aquí un protocolo para analizar las proteínas mal plegadas nucleares con una tasa de rotación lenta se describe ⁹. Una forma patógena de Ataxina-1 (ATXN1) que contiene un tramo de 82 glutaminas (ATXN1 82Q) se utiliza para este fin ^8. Cuando se expresa en las células, una proteína fluorescente (GFP) de fusión verde mejorada de formas ATXN1 82Q microscópicamente inclusiones visibles en el núcleo (Figura 1A). El análisis de persecución de impulsos revela que la vida media de Ataxn1 82Q es mayor de 18 h ^9. ATXN1 82Q se compone de especies con conformaciones mal plegadas de diferentes características, así como las especies con conformación nativa. Es probable que estas especies se degradan a diferentes velocidades, y por lo tanto debe ser analizado por separado. Los lisados ​​de ATXN1 82Q-GFP-expresando células se fraccionan en NP-40 soluble (soluble o NS, representando probablemente proteínas nativas o proteínas monoméricas / oligomérica mal plegadas) y (NI, agregado / mal plegadas) porciones NP-40 insoluble. Este último puede ser dividida en SDS-soluble (SS; probables agregados desordenados) o SDS-resistente (SR; fibrillas amiloides probablesFracciones) (Figura 1B). fracciones NS y SS pueden ser analizadas por SDS-PAGE seguida de Western Blot, mientras que la fracción SR puede ser detectada por ensayos de retardo en el filtro, seguido de inmunotransferencia. Persecución CHX se combina con el método de fraccionamiento detergente, y descubrió que la vida media de SS ATXN1 82Q es mucho más corta que la de NS ATXN1 82Q y el total de ATXN1 82Q (Figura 2A), indicando que la fracción de SS puede ser fácilmente reconocido y degradado en las células ^9. Por lo tanto, este método proporciona una herramienta poderosa para estudiar la dinámica de proteínas mal plegadas y comparar su patrón de degradación.

También describimos un método que es adecuado para la selección de alto rendimiento para la identificación de las macromoléculas o compuestos pequeños que pueden modular el degradación de las proteínas mal plegadas. Este método se basa en un mutante conformacionalmente desestabilizado de la luciferasa de luciérnaga (LucDM) ^17, un sustrato de modelo de chaperona. Tenemos fusibled LucDM a una señal de localización nuclear (NLS) para investigar los sistemas PQC en este compartimento celular, y GFP (NLS-LucDM-GFP) para la conveniencia de la detección. Formas NLS-LucDM-GFP agregados nucleares microscópicamente visibles en un pequeño porcentaje de células (Figura 3A). Al igual que en ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP, pero no su homólogo de tipo salvaje NLS-LucWT-GFP-es modificado por SUMO2 / 3 y regulada por la vía de PML-RNF4 ^9. NLS-LucDM-GFP también forma SS y SR especies, aunque las cantidades relativas de las especies SS y SR son mínimos en comparación con NS, usando las condiciones descritas en el protocolo 3 a continuación. Para simplificar el ensayo, sólo analizamos SDS LucDM soluble (incluyendo tanto los NS y fracciones SS) por SDS-PAGE y Western blot. Es importante destacar que, el ensayo de persecución CHX mostró que la vida media de SDS-soluble NLS-LucDM-GFP es mucho más corta que la de su homólogo de tipo salvaje (Figura 3B), lo que sugiere que LucDM es un sustrato específico para el sistema que reconoce y se degradaproteínas mal plegadas.

La degradación de LucDM-GFP causa una caída significativa de la señal global de fluorescencia. Por lo tanto, también hemos desarrollado un protocolo para la detección en tiempo real de celular LucDM-GFP usando un ensayo basado en la fluorescencia de microplacas. Muchos sistemas de alto rendimiento pantalla (HTS) son desarrollados por los medicamentos o genes modificadores agregados celulares y la viabilidad celular causado por las proteínas aberrantes ^18-20. Sin embargo, muy pocos HTS están diseñados específicamente para la orientación degradación en células de mamífero. Este protocolo sirve como un sistema robusto para el análisis rápido y en gran escala de los efectos de la expresión de proteínas, desmontables, y el tratamiento de drogas en la proteína mal plegada celular degradación. El uso de células HeLa como ejemplo, a continuación se describen los protocolos para el análisis de estas dos proteínas mal plegadas. Los ensayos también se pueden aplicar a otras líneas celulares, aunque pueden necesitar ser optimizado para líneas celulares individuales condiciones de transfección y el curso del tiempo.

Protocol

1. Preparación de Reactivo Preparar tampón de lisis celular (50 mM Tris, pH 8,8, NaCl 100 mM, 5 mM MgCl2, 0,5% NP-40). Suplemento DTT 2 mM, 1x cóctel completo de la proteasa, y 250 IU / ml benzonasa antes de su uso. Preparar el tampón de precipitado (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl 2). Suplemento DTT 2 mM, 1x cóctel completo de proteasa y 250 IU / ml benzonasa antes de su uso. Preparar tampón de ebullición 3x (6% de SDS, Tris 20 mM, pH 8,0). Suplemento de DTT 15…

Representative Results

En un análisis de estado estable, microscópicamente visibles agregados nucleares ATXN1 82Q-GFP se puede observar en 30 – 50% de las células HeLa 20 horas después de la transfección (Figura 1A). El análisis de transferencia Western de NS y SS fracciones usando anticuerpo anti-GFP muestra una banda distinta de ATXN1 82Q-GFP entre 100 kDa y 150 kDa marcadores, correspondiente al peso molecular de la proteína (Figura 1B). ATXN1 82Q-GFP en la fracción…

Discussion

Los mecanismos que regulan la degradación de las proteínas mal plegadas son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis de las proteínas celulares, y probablemente representan objetivos farmacológicos valiosos para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y otras enfermedades en proteínas misfolding. Aquí, se describen ensayos que examinan la degradación de las proteínas mal plegadas, utilizando una proteína patógena ATXN1 (ATXN1 82Q) y un mutante nuclear localizada luciferasa (NLS-LucDM) como ej…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11995-092
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10082147
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019
NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	L3771
MG132	Sigma-Aldrich	M8699
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Scientific	45000232
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Boehringer Mannheim	4693159001
Bio-Dot Apparatus	Bio-Rad	1706545
Living Colors GFP Monoclonal Antibody	Clonetech	632375
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG	Sigma-Aldrich	A45060-200UL
Amino acids	Sigma-Aldrich		Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium
Olympus IX-81  Inverted Fluorescence Microscope	Olympus	IX71/IX81
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom	Sigma-Greiner	89135-048
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO	TECAN	Infinite 200® PRO
Cellulose acetate membrane 0.2 µm	Sterlitech	CA023001
Prism 5	GraphPad		Statistical analysis software