Natte Chemie en Peptide immobilisatie op Polytetrafluoroethyleen voor betere Cel-adhesie
Summary
Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.
Abstract
Begiftigt materialen oppervlak met cell-hechtende eigenschappen is een gemeenschappelijke strategie in biomaterialen onderzoek en tissue engineering. Dit is vooral interessant voor reeds goedgekeurde polymeren die een langdurige toepassing in de geneeskunde omdat deze materialen zijn goed gekarakteriseerd en wetgeving die samenhangen met de introductie van nieuw gesynthetiseerde polymeren kunnen worden vermeden. Polytetrafluorethyleen (PTFE) is een van de meest gebruikte materialen voor het vervaardigen van vasculaire enten, maar mist de polymere cel adhesiebevorderende kenmerken. Endothelialisatie, dwz dat volledige dekking van de enten binnenoppervlak met een confluente laag van endotheelcellen beschouwd essentieel voor de optimale prestaties, vooral door het beperken trombogeniciteit van de kunstmatige interface.
Deze studie onderzoekt de groei van endotheliale cellen op peptide-gemodificeerde PTFE en vergelijkt deze resultaten met die verkregen met ongemodificeerde substraat. Koppeling met deendotheelcel lijm peptide Arg-Glu-Asp-Val (REDV) wordt uitgevoerd via activatie van de fluorin polymeer met het reagens natriumnaftalenide, gevolgd door achtereenvolgende conjugatie stappen. Celkweek wordt bewerkstelligd middels humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) en uitstekende celgroei on-peptide geïmmobiliseerd materiaal wordt aangetoond gedurende een periode van twee weken.
Introduction
Verschillende polymeren gebruikt in de geneeskunde die zijn goedgekeurd voor enige tijd niet verbeterde biocompatibiliteit, dat wil zeggen, gebrek aan cel-kleverigheid, inductie van fibrotische inkapseling en trombogeniciteit vertonen, om een paar te noemen. Interacties tussen het biomateriaal en het biologische systeem voornamelijk plaatsvindt aan het oppervlak van het implantaat. Dientengevolge is onderzoek gericht op oppervlaktemodificatie teneinde passende eigenschappen te creëren voor een gewenste toepassing terwijl de bulk van het materiaal beïnvloed. Polytetrafluorethyleen (PTFE) als een fysiologisch inert polymeer wordt gebruikt in vele medische gebieden zoals hernia chirurgisch gaas 1, medische poorten 2 en, belangrijker, vasculaire transplantaten 3.
Vooral in bloed contact situaties de hydrofobe aard van PTFE zorgt onspecifieke adsorptie van plasmacomponenten en bijgevolg bloedplaatjesadhesie, vaak resulterend in thrombotic gebeurtenissen en occlusie van het implantaat 4. Bovendien PTFE, zoals de meeste polymeren, ondersteunt celadhesie en dekking die zou een wenselijke eigenschap voor de vorming van een gunstig laag van endotheelcellen (EC) op de binnenzijde (luminaal) oppervlak van het vasculaire transplantaat 5 induceren. Een biomimetische endotheel wordt verwacht dat veel van de functies van de natuurlijke equivalent, met name de antitrombogene eigenschappen 6 voldoen. Een algemene biomimetische modificatie strategie is gebaseerd op het concept van uitsluitend begiftigt het materiaal cel-kleverigheid terwijl de materialen bulkeigenschappen onaangetast. Bovendien kunnen bloedplaatjesadhesie worden verminderd door reeds adhesie (aangroeiwerende) kenmerken 7. Verschillende peptiden – meestal afgeleid van eiwitten van de extracellulaire matrix – beschreven die sterk verbeteren celadhesie door binding aan cellulaire receptoren, die behoren tot de klasse van integrinen 8. het zijnst bekend voorbeeld in dit verband is het peptide Arg-Gly-Asp (RGD) die samenwerkt met de meeste celtypen. Andere aminozuursequenties worden herkend door integrinen exclusief tot expressie op specifieke cellen. Bijvoorbeeld, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) en Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) gevonden te binden aan EC aan een specifieke wijze 9. Covalente immobilisatie van dergelijke peptiden heeft op een overvloed aan inherent niet-zelfklevende materialen waaronder metalen en polymeren 10,11 uitgevoerd.
Poreus PTFE, nauwkeuriger geëxpandeerd PTFE (ePTFE) – samen met polyethyleentereftalaat (PET) – is de belangrijkste grondstof voor de productie van vasculaire transplantaten 12. Vastgesteld fysische technieken voor geschikte behandelingen, zoals plasma modificatie 13 of fotochemische methoden 14 worden bemoeilijkt doordat poreuze en / of buisvormige structuren zijn niet gemakkelijk te behandelen in de poriën of het lumen resp. natchemischeop PTFE is een moeilijke taak, omdat de zeer inerte aard van het fluorin bevattend polymeer dat de meeste chemische aanvallen 15 weerstaat.
In dit artikel beschrijven we een relatief gemakkelijke werkwijze voor covalente modificatie strategie. Aangepast van een procedure om PTFE bondable te maken, werden functionele groepen die zijn gemaakt op de materialen oppervlak die dienen als ankerpunten voor verdere vervoeging van biologisch actieve moleculen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gedetailleerde beschrijving van oppervlaktemodificatie protocol PTFE bestaat uit opeenvolgende stappen beginnen met de verwijdering van fluor uit het polymeerskelet zoals weergegeven in figuur 6. Hierdoor wordt een laag gevormd die een overvloedige hoeveelheid geconjugeerde koolstof-koolstof dubbele bindingen bevat in overeenstemming met de donkere bruine kleur die ontwikkeld op naphthalenide behandeling. Standard oxidatie met zure waterstofperoxide levert een gehydroxyleerd oppervlak vergezeld van v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the help of Walter Scholdei (Max-Planck-Institute for Polymer Research, Mainz, Germany.
Materials
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95 % purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30 % | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
Riferimenti
- Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
- Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
- Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S. Bioengineered blood vessels. Exp. Opin. Biol. Th. 14, 403-410 (2014).
- Wang, M. -. J., Tsai, W. -. B. . Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , (2010).
- de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
- Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
- Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
- Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
- Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
- Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
- Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, 119-139 (2009).
- Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S. Plasma-based biofunctionalization of vascular implants. Nanomedicine UK. 7, 1907-1916 (2012).
- Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
- Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007 (2011).
- Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
- Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
- Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
- Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).
