Влажные химии и пептидный иммобилизации на политетрафторэтилена для улучшенного клеточной адгезии
Summary
Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.
Abstract
Наделение материалы поверхность с клеточно-адгезионные свойства является общей стратегией в исследовании биоматериалов и тканевой инженерии. Это особенно интересно для уже утвержденных полимеров, которые имеют длительный срок использования, стоя в медицине, так как эти материалы хорошо охарактеризованы и правовые вопросы, связанные с введением новых синтезированных полимеров можно избежать. Политетрафторэтилен (PTFE), является одним из наиболее часто применяемых материалов для изготовления сосудистых тканей, но полимер испытывает недостаток клеток, усиливающего адгезию особенности. Эндотелиализацию, то есть полный охват трансплантатов внутренней поверхности с вырожденным слоем эндотелиальных клеток считается ключом к оптимальной производительности, в основном , за счет снижения тромбогенности искусственного интерфейса.
Это исследование исследует рост эндотелиальных клеток на пептид-модифицированный ПТФЭ, и сравнивает эти результаты, полученные на немодифицированной подложке. Сцепление сэндотелиальный клей клетка пептид Arg-Glu-Asp-Val (REDV) осуществляется через активацию Fluorin полимера, содержащего, используя реагент нафталинид натрия с последующим последующих стадий конъюгации. Культура клеток осуществляется с использованием человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVECs) и отличный клеточный рост на пептидной иммобилизованным материале демонстрируется в течение двух недель.
Introduction
Различные полимеры , используемые в медицине , которые были утверждены в течение некоторого времени не проявляют повышенную биосовместимость, т.е. отсутствие клеток-липкости, индукцию фиброзной капсулой и тромбообразования, чтобы упомянуть некоторые из них. Взаимодействие между биоматериала и биологической системы происходит в основном на поверхности имплантата. Как следствие этого, исследование сосредоточилось на модификации поверхности для того, чтобы создать соответствующие свойства для требуемого применения, оставляя объемные свойства материала не изменяются. Политетрафторэтилена (ПТФЭ) в качестве физиологически инертный полимер используется во многих областях медицины , таких как грыжа хирургической сетки 1, медицинские порты 2 и, самое главное, сосудистых трансплантатов 3.
Особенно в крови контактирование ситуации гидрофобный характер PTFE вызывает неспецифическую адсорбцию компонентов плазмы и, как следствие адгезии тромбоцитов, что часто приводит к thrombotiC события и закупорка трансплантата 4. Кроме того, из ПТФЭ, как и большинство полимеров, не поддерживает клеточную адгезию и покрытие , которое было бы желательным признаком , чтобы вызвать образование полезного слоя эндотелиальных клеток (ЭКС) на внутренней (полостной) поверхности сосудистой трансплантата 5. Биомиметический эндотелий , как ожидается , выполнять многие из функций его естественного эквивалента, в частности , его антитромбогенные свойства 6. Общая биомиметический стратегия модификации основана на концепции исключительно наделение материал с клеточной адгезионной способностью, оставляя материалы объемные свойства не изменяются. Кроме того, адгезия тромбоцитов может быть уменьшена за счет включения антиадгезионного (анти-обрастания) признаки 7. Различные пептиды – в основном полученные из протеинов внеклеточного матрикса – были описаны , что сильно повысить клеточную адгезию путем связывания с клеточными рецепторами, принадлежащий к классу интегринов 8. БытиеSt известным примером в этом отношении является пептид Arg-Gly-Asp (RGD), который взаимодействует с большинством типов клеток. Другие аминокислотные последовательности распознаются интегринов экспрессируется исключительно на конкретных клетках. Например, Арг-Glu-Asp-Val (REDV) и Тир-Иле-Гли-Ser-Arg (YIGSR) было обнаружено, что связываться с КЧС определенным образом 9. Ковалентной иммобилизации таких пептидов было проведено на изобилием по своей природе не липких материалов , включая металлы и полимеры 10,11.
Пористый ПТФЭ, более точно расширен ПТФЭ (ПТФЭ) – наряду с полиэтилентерефталата (ПЭТ) – это наиболее важный материал для производства сосудистых трансплантатов 12. Установленные физические методы для надлежащего лечения, такие как модификация плазмы 13 или фотохимическим методами 14, затруднены тем , что пористые и / или трубчатые структуры не легко поддается лечению в порах или просвет соответственно. Влажная химияПТФЭ является сложной задачей из-за чрезвычайно инертной природы Fluorin содержащего полимер , который противодействует большинство химических атак 15.
В этой статье мы опишем сравнительно легкое метод стратегии ковалентной модификации. Адаптировано из процедуры для визуализации ПТФЭ к связыванию, функциональные группы были созданы на поверхности материалов, которые служат в качестве опорных точек для дальнейшего сопряжения биологически активных молекул.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подробное описание протокола модификации поверхности ПТФЭ состоит из последовательных этапов , начиная с преодолением фтора из полимерной цепи , как показано на рисунке 6. В результате, слой образуется , который содержит большое количество конъюгированных двойных углерод-угл…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the help of Walter Scholdei (Max-Planck-Institute for Polymer Research, Mainz, Germany.
Materials
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95 % purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30 % | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
Riferimenti
- Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
- Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
- Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S. Bioengineered blood vessels. Exp. Opin. Biol. Th. 14, 403-410 (2014).
- Wang, M. -. J., Tsai, W. -. B. . Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , (2010).
- de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
- Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
- Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
- Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
- Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
- Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
- Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, 119-139 (2009).
- Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S. Plasma-based biofunctionalization of vascular implants. Nanomedicine UK. 7, 1907-1916 (2012).
- Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
- Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007 (2011).
- Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
- Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
- Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
- Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).
