Protocollo per la conversione diretta dei fibroblasti murini embrionali in trofoblasto cellule staminali

Summary

Qui presentiamo un protocollo per la conversione diretta di fibroblasti embrionali murini in cellule staminali del trofoblasto completamente funzionali e stabili mediante sovraespressione di dieci giorni di Tfap2c, Gata3, Eomes ed Ets2.

Abstract

cellule staminali Trophoblast (TSC) sono una conseguenza della prima decisione destino cellulare in sviluppo dei mammiferi. Essi possono essere coltivate in vitro, mantenendo la capacità di auto-rinnovarsi e di differenziarsi in tutti i sottotipi del lineage trofoblasto, equivalenti in vivo staminali popolazione cellulare dando luogo alla parte fetale della placenta. Pertanto, TSC offrono un modello unico per studiare lo sviluppo placentare ed embrionale rispetto a extra-embrionali decisione destino della cellula in vitro. Dal stadio di blastocisti in poi, una barriera epigenetica distinta composto da metilazione del DNA e degli istoni modifiche separa ermeticamente entrambe le linee. Qui, descriviamo un protocollo per superare questa barriera completamente lignaggio da transitori sovra-espressione del trofoblasto regolatori chiave Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 in fibroblasti embrionali murini. Le cellule staminali del trofoblasto indotte sono in grado di auto-rinnovarsi e sono quasi identiche a blastocisti di cellule staminali derivate trofoblasto in termini di morfologia, l'espressione del gene marcatore e modello di metilazione. Funzionale in vitro e in vivo confermano che queste cellule sono in grado di differenziarsi lungo lignaggio trofoblasto generare cellule giganti poliploide trofoblasto e chimerizing la placenta quando iniettato in blastocisti. L'induzione di cellule staminali dal tessuto trofoblasto somatica apre nuove strade per studiare le caratteristiche genetiche ed epigenetiche di questo lignaggio extra-embrionale e offre la possibilità di generare linee di cellule staminali trofoblasto senza distruggere l'embrione rispettivo.

Introduction

Recentemente, uno studio di confronto diversi approcci di topo cellule staminali embrionali di trofoblasto conversione delle cellule staminali ha rivelato che in tutti i sistemi analizzati, la conversione lignaggio è rimasto incompleto. Invece di cellule staminali indotte (trofoblasto) iTSCs cosiddette staminali trofoblasto cellule simili alle cellule sono stati generati conservando un ricordo del destino delle cellule di origine ^1. Qui, abbiamo seguito un approccio diverso di generazione ITSC. Simile a l'induzione diretta di cellule staminali pluripotenti da murine fibroblasti embrionali (MEF) ^2, iTSCs sono stati convertiti direttamente dal....

Protocol

Tutti gli esperimenti di topo sono stati condotti secondo la legge tedesca di protezione degli animali e in accordo con l'approvazione dei comitati per la cura degli animali istituzionali locali (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nord Reno-Westfalia [numero ID di approvazione: AZ 84-02.04.2013 .A428]).

1. Carta Preparazione

1. Preparare 293T media: Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM), 10% (v / v) di FBS, L-glutamina (2 mM), piruvato di sodio (1 mM), penicillina / streptomicina (1x).
2. Preparare medio MEF: DMEM, 10% (v / v) di FBS, L-glutamina (2 mM), aminoacidi non essenziali 1x, penicillina / st....

Results

Sul piatto dove viene attivato espressione del transgene della 4F, cellule cambiano rapidamente morfologia (confrontare Figura 2A e B). Intorno giorno 14 - 21 aree distinte transdifferentiated emergono (due esempi sono riportati nella figura 2B e C). Queste colonie primarie mancano morfologia tipica TSC; tuttavia una volta che sono sub-coltura, morfologia caratteristica epiteliale con bordi stretti e confini luminosi ricorda molto da vicino TSC in buona .......

Discussion

Il 4 fattore (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) protocollo transdifferenziazione basato qui presentata offre un metodo affidabile per generare fedelmente convertito iTSCs da fibroblasti embrionali di topo. Inoltre, il metodo è applicabile anche per i fibroblasti coda post-natale, anche se con un calo di efficienza rispetto ai fibroblasti embrionali ^3. In generale, la qualità dei fibroblasti primari è un fattore critico di esito transdifferenziazione e occorre prestare attenzione a utilizzare le cellule di passaggio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Doxiciclina iclilato	Sigma-Aldrich	D9891-10G	Sciogliere in PBS sterile, preparare 2 mg/ml di soluzione madre. Conservare le aliquote a -20 ° C
Clorochina difosfato sale	Sigma-Aldrich	C6628-25G	Preparare 25 mM di soluzione madre in acqua sterile per colture cellulari. Conservare le aliquote a -20 ° C
Polibrene (bromuro di esadimetrina)	Sigma-Aldrich	107689-10G	Preparare una soluzione madre da 8 mg/ml in acqua sterile per colture cellulari. Conservare le aliquote a -20 ° C
fattore di crescita dei fibroblasti ricombinanti umani 4	ReliaTech	300-131L	Sciogliere in sterile 0,1% BSA in PBS, preparare 25 &; g/ml di soluzione madre. Conservare le aliquote a -80 ° C
Eparina sale sodico	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Preparare 1 mg/ml di soluzione madre sciogliendola in PBS sterile. Conservare le aliquote a -80 gradi C
ProFection Sistema di trasfezione per mammiferi	Promega	E1200
PBS, senza calcio, senza magnesio	ThermoFisher Scientific	1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	31966-021
RPMI 1640, senza glutammina	ThermoFisher Scientific	31870-025
Advanced DMEM (1x)	ThermoFisher Scientific	12491-015
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo	ThermoFisher Scientific	25300-054
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P4707
Siero fetale bovino	Hyclone	SH30071.03IR
Filtro a membrana in acetato di cellulosa senza tensioattivi	Corning	431220
Aminoacidi	non essenzialiThermoFisher Scientific	11140-035
Penicillina Streptomicina	ThermoFisher Scientific	15140-122
Piruvato di sodio	ThermoFisher Scientific	11360-039
L-glutammina	ThermoFisher Scientific	25030-24
2-mercaptoetanolo	ThermoFisher Scientific	31350-010
Dimetilsolfossido (DMSO), grado per colture cellulari	Panreac AppliChem GmbH	A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c	Addgene	70269
pLV-tetO-Gata3	Addgene	70270
pLV-tetO-Eomes	Addgene	70271
pLV-tetO-Ets2	Addgene	70272
pLV-tetO-mCherry	Addgene	70273
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
FUdeltaGW-rtTA	Addgene	19780
Topi B6. Cg-GT(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7	JAX Mice	6965
129S2SV	Charles River	129