Protokoll for direkte konvertering av Murine embryonale Fibroblaster i trophoblast stamceller
Summary
Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.
Abstract
Trophoblast stamceller (TSC-ene) oppstår som en konsekvens av den første cellen skjebne avgjørelse i pattedyr utvikling. De kan dyrkes in vitro, beholder evnen til å fornye seg selv og til å differensiere i alle undergrupper av trophoblast avstamning, tilsvarende in vivo stamcelle befolkningen gir opphav til foster del av morkaken. Derfor TSC-ene tilbyr en unik modell for å studere placenta utvikling og embryonale versus ekstra-embryonale celle skjebne beslutning in vitro. Fra blastocyststadiet og utover, en distinkt epigenetisk barriere som består av DNA metylering og histonmodifikasjonene tett skiller begge linjene. Her beskriver vi en protokoll for å fullt ut overvinne denne avstamning barriere ved forbigående over uttrykk for trophoblast viktige regulatorer Tfap2c, Gata3, Eomes og ETS2 i murine embryonale fibroblaster. De induserte trophoblast stamceller er i stand til å fornye seg selv, og er nesten identisk med blastocyst avledet trophoblast stamceller in gjelder morfologi, men da genekspresjon og metylering mønster. Funksjonelt in vitro og in vivo-analyser bekrefter at disse cellene er i stand til å differensiere langs linjen trophoblast generer polyploid trophoblast kjempeceller og chimerizing placenta når de injiseres inn i blastocyster. Induksjon av trophoblast stamceller fra somatisk vev åpner nye veier for å studere genetiske og epigenetiske kjennetegn ved denne ekstra-embryonale avstamning og tilbyr muligheten til å generere trophoblast stamcellelinjer uten å ødelegge den respektive embryo.
Introduction
Nylig har en studie som sammenlignet flere tilnærminger av mus embryonale stamceller til trophoblast stamceller konvertering avslørte at i alle analyserte systemer, forble avstamning konvertering ufullstendig. I stedet for å induserte trophoblast stamceller (iTSCs) såkalte trophoblast stamcelle-lignende celler har blitt generert beholder en hukommelse av cellen skjebne opprinnelse 1. Her fulgte vi en annen tilnærming av iTSC generasjon. I likhet med den direkte induksjon av pluripotente stamceller fra muse embryonale fibroblaster (MEFs) 2, har iTSCs vært direkte konvertert fra differensiert somatisk vev. Først identifiserte vi 12 kandidat faktorer som induserer TSC skjebne når overexpressed i MEFs. Senere har de faktorene Tfap2c, Gata3, Eomes og ETS2 blitt identifisert til å være nødvendig og tilstrekkelig for iTSC induksjon tre. Samtidig, en annen gruppe uavhengig funnet Tfap2c, Gata3 og Eomes å være tilstrekkelig til å konvertere MEFs inn iTSCs. Men i såStudien er den tiden som kreves for transgene uttrykk vesentlig lengre enn vår studie, som viser forskjellige konverteringskinetikk, når ETS2 er fraværende fra transdifferensiering cocktail fire.
Konvensjonell føtalt bovint serum (FBS) inneholdende kultur av indusert og blastocyst avledet trophoblast stamceller er avhengig av tilstedeværelse av faktorer som utskilles av vekst-inaktivert MEFs 5,6. Under iTSC induksjon, er disse faktorene leveres av MEFs, som mangler den fullstendige kombinasjonen av transgener og ikke gjennomgår transdifferensiering. Men når enkelte iTSC kolonier er sub-kultivert, de krever media, som har blitt forbehandlet av vekst inaktivert MEFs. Derfra kan iTSCs dyrkes og behandlet som blastocyst avledet TSC-ene i henhold til standard protokoller. Av notatet, i motsetning til al. Tanaka et fem, vi rutinemessig kultur TSC-ene og iTSCs uten gelatinecellekultur retter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den 4-faktor (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) basert transdifferensiering protokoll som presenteres her gir en pålitelig metode for å generere trofast konvertert iTSCs fra mus embryonale fibroblaster. Videre er metoden også for post-natal hale fibroblaster, selv med en nedgang i effektivitet sammenlignet med embryonale fibroblaster 3. Generelt, kvaliteten på primær fibroblaster er en kritisk faktor for transdifferensiering utfall og omsorg bør tas for å bruke tidlige passasje cellene (passasje 02:58).
…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
Riferimenti
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
