الفجوة صلي بين الخلايا الاتصالات: العلامات البيولوجية الوظيفية لتقييم التأثيرات السلبية للالسميات والسموم، والصحة فوائد المنتجات الطبيعية
Summary
يصف هذا البروتوكول مشرط التحميل الفلورسنت صبغة تقنية نقل الذي يقيس الاتصالات بين الخلايا من خلال القنوات الفجوة تقاطع. فجوة الاتصال بين الخلايا وصلي هو عملية الخلوية الرئيسية التي يتم من خلالها الحفاظ على توازن الأنسجة وتعطيل هذه الإشارات الخلوية له تأثيرات صحية سلبية.
Abstract
يصف هذا البروتوكول مشرط التحميل الفلورسنت نقل صبغة تقنية (SL-DT) الذي يقيس الاتصالات بين الخلايا من خلال القنوات تقاطع الفجوة، والتي هي عملية بين الخلايا الرئيسية التي يتم من خلالها الحفاظ على توازن الأنسجة. وقد تم ربط انقطاع الفجوة موصلي الاتصالات بين الخلايا (GJIC) من خلال المواد السامة والسموم والمخدرات، وما إلى ذلك العديد من الآثار السلبية على الصحة. وقد تم ربط العديد من الأمراض التي تصيب الإنسان مقرها الوراثية إلى حدوث طفرات في الجينات الفجوة تقاطع. تقنية SL-DT هو فحص وظيفي بسيط لتقييم في وقت واحد GJIC في عدد كبير من الخلايا. الفحص يشمل خلايا التحميل المسبق مع صبغة الفلورسنت ذلك عن طريق تشويش لفترة وجيزة في غشاء الخلية بشفرة مشرط من خلال مجموعة من الخلايا. ثم يسمح للصبغة الفلورسنت لاجتياز من خلال قنوات الفجوة تقاطع إلى الخلايا المجاورة لفترة معينة. ثم يتم إنهاء فحص بإضافة الفورمالين إلى الخلايا. انتشار فلووويتم تقييم صبغ rescent من خلال مجموعة من الخلايا مع مجهر epifluorescence ويتم تحليل الصور مع أي عدد من حزم البرامج المظهرية المتوفرة، بما في ذلك حزم البرمجيات الحرة وجدت في المجال العام. كما تم تكييف هذا الاختبار لفي الدراسات المجراة باستخدام شرائح الأنسجة من الأجهزة المختلفة من الحيوانات المعالجة. عموما، يمكن فحص SL-DT تخدم مجموعة واسعة من في المختبر الاحتياجات الدوائية والسمية، ويمكن أن يحتمل تكييفها لانشاء نظم إنتاجية عالية مع مضان الآلي التصوير المجهري والتحليل لتوضيح المزيد من العينات في وقت أقصر.
Introduction
ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير تقنية بسيطة وشاملة وغير مكلفة نسبيا لتقييم السمية المحتملة للمركبات. هذا هو النهج في المختبر والتي يمكن استخدامها في خطوط الخلايا متعددة. يمكن القياسية مختبرات البيولوجيا الخلوية المزودة المجاهر epifluorescence إجراء البحوث باستخدام هذا الاختبار.
لقد كان لدينا المعرفة الأساسية من وظائف الخلية يعتمد بشكل كبير على اختبارات بيولوجية في المختبر، وأصبحت عنصرا أساسيا في تقييم السمية للأدوية، والملوثات البيئية، والملوثات الغذائية ولدت. للأسف، لا يوجد في المختبر النظام الأحيائي واحد التي يمكن أن تلبي شامل لمطالب لجميع التقييمات السمية. العديد من فحوصات المختبر تم تصميم والأمثل لتقييم وكذلك تقييم نقطة نهاية البيوكيميائية أو جزيئية محددة. وهذه في كثير من الأحيان جنبا إلى جنب في إنتاجية عالية شكلت لتعكس الاضطراب لمعين مسار نقل الإشارة، مثل مستقبلات هرمون الاستروجين مما يشير إلى 1. وكانت هذه الاستراتيجية ناجحة جدا، ولكن عددا كبيرا من مسارات نقل الإشارة المشاركة في التعبير الجيني يجعل مهمة اختيار مسار الإشارات المحددة لتقييم معقدة جدا. ويجري حاليا إعداد عالية البروتوكولات من خلال-وضع وتستخدم لقياس وقت واحد العديد من مسارات إشارات، الذي كان نهج واحد للتغلب على بعض أوجه القصور في المقايسات واحدة. ومع ذلك، فقد أدرجت ليس كل مسارات إشارات بنجاح إلى نهج أكثر شمولا، بالإضافة إلى مسارات الإشارات جديدة يجري باستمرار اكتشفت أن يزيد من تعقيد عملية التقييم هذه. استخدام الأرقام واسعة من النهج في المختبر، وخاصة من خلال ارتفاع-وضع أنظمة لتقييم السمية الشاملة هي أيضا مكلفة للغاية وغير مواتية لمعظم محقق واحد أدى المشاريع البحثية.
GJIC هو القصبات عمليةتسيطر htly تغيرات في التيار الكهربائي، وتركيز الكالسيوم، ودرجة الحموضة، والتوازن الأكسدة، التي تنظمها مسارات الإشارات بين الخلايا التنبيغ الرئيسية والتفاعل مع الغشاء والهيكل الخلوي البروتينات 2،3. وهكذا، وتثبيط GJIC يمكن أن تعكس أنواع مختلفة من الإجهاد الخلوية، وتعطل الوظائف الخلوية المختلفة، أو اضطرابات من مختلف مسارات نقل الإشارة. مقاربة أخرى للتغلب على استخدام محدودة اختبارات بيولوجية نقل الإشارة هو الاستفادة من الظواهر البيولوجية أن الكثير، إن لم يكن أكثر، والتضمين مسارات نقل الإشارة كذلك من قبل أنظمة الإشارات بين الخلايا التعاونية من خلال قنوات الفجوة تقاطع 4-8. على الرغم من أن أنظمة الإشارات بين الخلايا هي أيضا عديدة وتحت السيطرة مسار متعددة، إشارات بين الخلايا من خلال القنوات تقاطع الفجوة في النهاية وظيفة من القنوات التي يتم فتحها، مغلقة جزئيا أو مغلقة تماما. وهذا يوفر نقطة النهاية التي يمكن قياسها بسهولة باستخدام مختلففي أنظمة الأحيائي المختبر 7. وبالنظر إلى أن نقطة مجموعة التماثل الساكن من الأنسجة يتطلب فتح قنوات، وتحديد تأثير المركبات على الفجوة موصلي الاتصالات بين الخلايا (GJIC) هو نهج أكثر شمولا في تحديد الآثار السمية المحتملة للمركبات 4،8. في جوهرها، وهذه الظاهرة البيولوجية الهامة التي تلعب دورا محوريا في تنسيق متعددة الأحداث نقل الإشارة السيطرة على التعبير الجيني يسمح لتقييم واسعة من الآثار السمية. وهكذا، اختبارات بيولوجية التي تقيم GJIC هي نقطة انطلاق ممتازة لتقييم إمكانية السامة من المركبات.
وتستند هذه التقنيات الأكثر شمولا المستخدمة لتقييم GJIC على تحميلها مسبقا الخلايا مع التحقيق الفلورسنت ثم مراقبة هجرة الصبغة من خلية تحميل أو الخلايا إلى الخلايا المجاورة. وقد شملت التقنيات لتهيئة تحميلها على صبغ حقن مكروي 9، كشط تحميل 10، والميثيل استرات تحقيقات 11 </suص>. مشرط التحميل الفلورسنت نقل صبغ (SL-DT) الأسلوب هو تعديل للتحميل كشط – صبغ نقل فحص وضعتها الفولي 10. بدلا من كشط أكثر الغازية، وطريقة مشرط تحميل هذا التقرير ينطوي على لفة لطيف من مشرط بشفرة الجولة من خلال أحادي الطبقة من الخلايا التي تقليل الضرر الغازية (الشكل 1). مزايا هذه التقنية هي تقييم السمية من مجموعة من الخلايا بدلا من الخلايا واحد من الفحص حقن مكروي. وعلاوة على ذلك، وبساطة هذا الاختبار يسمح للكشف السريع لوحات متعددة في وقت قصير في حين طرق استخدام التقنيات والأساليب التي تستخدم استرات الميثيل من تحقيقات الفلورسنت حقن مكروي بشكل ملحوظ أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب أعلى بكثير مستوى المهارة.
رغم عدم وجود طريقة واحدة لتلبية جميع احتياجات دراسة GJIC. فحص SL-DT هو فحص بسيط وغير مكلفة إلى حد ما ومتعدد الاستعمالات التي يمكنتلبية العديد من احتياجات التقديرات الأولية من السميات من المركبات المختلفة. وتشمل المزايا الرئيسية: البساطة، لا حاجة خاصة للمعدات أو المهارات المطلوبة لأساليب أخرى مثل حقن مكروي، والانتعاش الفلورسنت بعد photobleaching من (FRAP) فحص وتفعيل المحلي الجزيئية فحوصات التحقيق الفلورسنت، والتقييم السريع والمتزامن لGJIC بشكل كبير عدد من الخلايا، يفضي إلى ارتفاع الإنتاجية انشاء مع مضان الآلي التصوير المجهري والتحليل، وكذلك قدرتها على التكيف للدراسات في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
فحص SL-DT هي تقنية بسيطة وتنوعا في قياس GJIC، ولكن هناك العديد من المخاوف الحرجة التي يجب أخذها في الاعتبار في تصميم البروتوكولات التجريبية المناسبة. لقياس قوة من GJIC باستخدام فحص SL-DT يجب أن يكون هناك انتشار صبغ جيد للLY من خلال تقاطعات الفجوة من الخلايا. في الحد الأدنى، وين…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIEHS grants #R01 ES013268-01A2, and the contents are solely the responsibility of the author and do not necessarily represent the official views of the NIEHS, and supported by CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.
Materials
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3819–01 | |
| KH2PO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker – Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 mL conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system. | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| Image J | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Riferimenti
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C., Travis, C. C. . Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. , 165-179 (1989).
- Trosko, J. E., Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. . Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. , 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H., Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. , 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. r. o. s. k. o., Dittmar, T., Zaenkar, K. . Stem Cells and Cancer. , 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
